SSMP的结构解析及在拟南芥抗盐过程中的作用.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(4):804-812 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.04.18 SSMP的结构解析及在拟南芥抗盐过程中的作用 张海丽，由诗东，张 昊，高 静，李生辉，张利辉，邢继红，王凤茹，董金皋 （河北农业大学生命科学学院植物分子病理学实验室，河北保定 071001 ） 摘要： 【目的】解析SSMP（salt-sensitive membrane protein）的结构，明确SSMP的表达特性，预测和分 析SSMP在拟南芥逆境胁迫过程中的作用。【方法】利用生物信息学方法，解析SSMP的结构特征；利用Real-time PCR技术分析SSMP的时空表达特性；利用SSMP-GFP融合技术转化拟南芥叶片原生质体，对SSMP进行亚细胞定位； 构建 SSMP 的启动子连接报告基因 GUS 的表达载体，转化野生型拟南芥，通过染色方法观察报告基因 GUS 的表达情 况，从而进行 SSMP 的组织定位分析；构建 SSMP 过表达载体，利用农杆菌侵染花絮法转化拟南芥，qRT-PCR 技术 验证过表达SSMP拟南芥阳性苗，分析过表达SSMP拟南芥的表型并进行抗逆性分析，明确SSMP的生物学功能；利 用电导仪法比较过表达 SSMP 拟南芥和野生型拟南芥叶片的细胞膜透性，分析 SSMP 在拟南芥抵抗逆境胁迫过程中 的作用。【结果】生物信息学分析表明，SSMP含有START（the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains）保守域、共 411个氨基酸，具有磷脂酰胆碱的结合位点，预测SSMP可能影响膜的组成。对SSMP 的高级结构进行解析，SSMP 含有9个反平行的β-折叠和2个α-螺旋，形成1个明显的疏水腔，N端的 α-螺旋在 疏水腔外，另一个 α-螺旋形成疏水腔的盖子结构。Real-time PCR 对拟南芥的不同组织及发育时期的 SSMP 表达 量的分析表明，SSMP在拟南芥各组织中均有表达，表达量由高到低的顺序依次为茎生叶、莲座叶、茎、根、花和 种子。SSMPpro::GUS 转基因拟南芥幼苗的染色结果表明，在正常情况下，GUS 主要在下胚轴、整个子叶和真叶的 叶脉及表皮毛处表达；50 mmol·L-1 NaCl处理后，GUS在下胚轴和子叶中表达没有明显的变化，但在真叶中的表达 减少；100 mmol·L-1 NaCl 处理后，GUS 的表达在下胚轴、子叶和真叶中都明显减少，子叶中 GUS 主要在叶脉处表 达，在真叶中仅在顶端还有表达，这说明SSMP的表达受NaCl抑制。激光共聚焦显微镜488 nm波长下对SSMP-GFP 的亚细胞定位进行观察，SSMP 主要定位在细胞质膜上。过表达 SSMP 转基因拟南芥的细胞膜透性增加，不利于植 物的抗逆性。进一步的萌发试验对过表达SSMP的转基因拟南芥的萌发率和转绿率进行了统计分析，结果表明，过 表达SSMP明显抑制拟南芥种子的萌发。【结论】SSMP是具有磷脂酰胆碱结合位点的共411个氨基酸的蛋白质，含 START 结构域，主要位于细胞质膜上；在拟南芥各组织中均有表达，尤其在叶片中表达量最高，主要定位在整个 子叶和真叶的叶脉及表皮毛着生处；SSMP 的表达受盐胁迫的抑制；过表达 SSMP 的拟南芥细胞膜透性增加，耐盐 性降低。 关键词：拟南芥；SSMP；结构解析；表达特性；耐盐性 Structure Analysis of SSMP and Its Function in Salt Tolerance in Arabidopsis thaliana ZHANG Hai-li, YOU Shi-dong, ZHANG Hao, GAO Jing, LI Sheng-hui, ZHANG Li-hui, XING Ji-hong, WANG Feng-ru, DONG Jin-gao (Laboratory of Molec