茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(2):325-333 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.02.012 茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析 1,2 1 1 1 1 1 马成英 ，吕海鹏 ，林 智 ，张 悦 ，郭 丽 ，谭俊峰 1 2 （中国农业科学院茶叶研究所/茶叶加工工程研究中心，杭州 310008； 中国农业科学院研究生院，北京 100081 ） 摘要：【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮 O- 甲基转移酶基因，并对其进行生物信息学 分析，构建该基因的原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白，为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲 基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法，以从茶树叶片中提取的总RNA 为模板，结合 RT-PCR 与RACE 克隆技术获得该基因cDNA 全长，测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a 中， 转化大肠杆菌 BL21 并诱导表达。【结果】该基因 cDNA 全长为 1 246 bp，其开放阅读框为 1 077 bp，编码 358 个氨基酸，推测的蛋白分子量为 40.2 kD，理论等电点为 5.62；其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的 类黄酮 O- 甲基转移酶基因相似性分别为80%和 81%；经 IPTG 诱导和 SDS检测，所构建的原核表达载 体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR 与RACE 克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个 类黄酮O- 甲基转移酶基因，成功构建了原核表达载体，并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。 关键词：茶树；类黄酮O- 甲基转移酶；克隆；原核表达 Cloning and Prokaryotic Expression of Flavonoid O-methyltransferase from Camellia sinensis 1,2 1 1 1 1 1 MA Cheng-ying , LÜ Hai-peng , LIN Zhi , ZHANG Yue , GUO Li , TAN Jun-feng 1 ( Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Engineering Research Center for Tea Processing, Hangzhou 310008 ; 2Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081) Abstract: 【Objective 】Cloning, sequence analysis of the CsFOMT genes from Camellia sinensis and expression of recombinant proteins in Escherichia coli were conducted to further research the enzymatic characteristics and the metabolic mechanism of regulating the flavonoid in tea plant