大丽轮枝菌分泌蛋白提取方法比较.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(12):2348-2356 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.12.007 大丽轮枝菌分泌蛋白提取方法比较 肖红利，桂月晶，祁伟彦，陈捷胤，李 蕾，徐 明，戴小枫 （中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193） 摘要：【目的】采用超滤法（UF ）、三氯乙酸沉淀法（TCA ）、离子交换富集法（IEX ）分别从大丽轮枝菌 （Verticillium dahliae ）高致病性菌株VdG1 培养上清液中提取分泌蛋白，对提取样品进行质谱鉴定。寻找适合 大丽轮枝菌分泌蛋白的提取方法，为大丽轮枝菌分泌蛋白组深入研究奠定基础。挖掘大丽轮枝菌分泌蛋白中潜在 的致病相关蛋白，为其深入功能验证及致病机理研究提供平台。【方法】3 种方法提取大丽轮枝菌VdG1 分泌蛋白， shot-gun 方法进行质谱鉴定。利用生物信息学软件WoLFPSORT、SignalP、TMHMM、PHOBIUS 对其中经典分泌蛋白 进行预测。通过CAZy 和PHI 数据库进行经典分泌蛋白中碳水化合物水解酶（CAZy ）和病原菌寄主互作因子（PHI ） 注释，BLASTp 软件进行RxLx、LysM、Cys Pattern 等模体蛋白比对分析。提取的蛋白样品接种感病棉种（军棉1 号）进行样品生物学活性及致病性检测。【结果】TCA 法、IEX 法和UF 法制备大丽轮枝菌分泌蛋白，其提取效率分 -1 别为1.18、0.96 和0.56 mg∙L 。SDS电泳检测显示UF 法提取的蛋白样品条带少而模糊。而TCA 法和IEX 法 提取的蛋白样品条带较多，样品的纯度也较高；经生物信息学软件预测分析，提取的蛋白样品中含有经典分泌蛋 白分别为124、112 和75 个；质谱鉴定的分泌蛋白中含有潜在致病因子分别为 98、85 和 57 个；另外，IEX 法制 备大丽轮枝菌分泌蛋白效果较好，具有小分子偏好性，且能够保持样品的生物学活性，该蛋白样品接种棉花叶片 能够引起萎蔫、坏死的症状。【结论】3 种方法提取大丽轮枝菌分泌蛋白，UF 法提取效率最低，纯度最差，蛋白数 量最少，蛋白样品中含有潜在的毒素蛋白数量也最少，而且对于大体积处理相当耗时。TCA 法和 IEX 法都适合大 丽轮枝菌分泌蛋白的制备，但是TCA 法制备过程中不能保持样品的生物学活性，后续适合于2-D 电泳检测等试验。 IEX 法首次应用于病原菌分泌蛋白的制备，操作简单、方便，全部过程均由仪器系统完成。制备的大丽轮枝菌分 泌蛋白具有生物学活性，能够引起棉花叶片的萎蔫、坏死病症。另外，数据库及软件比对分析发现大丽轮枝菌分 泌蛋白组中含有CAZy 酶类61 个、PHI 相关蛋白 38 个、RxLx 模体蛋白 13 个、LysM 模体蛋白 1 个、Cys Pattern 的模体蛋白15 个、VdNEP 蛋白家族2 个。该结果将为致病相关蛋白的筛选和深入功能验证提供重要依据。 关键词：大丽轮枝菌；分泌蛋白；提取方法；LC-MS/MS；比较 Comparison of Secretome Extraction Methods in Verticillium dahliae XIAO Hong-li, GUI Yue-jing, QI Wei -yan, CHEN Jie-yin, LI Lei, XU Ming, DAI Xiao-feng (Institute of Agro-Products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193 ) Abstract: 【Objective 】The objective of this study is to identify the high efficient method for secreted protein extraction in Verticilli