大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系的建立.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(14):2747-2756 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.14.006 大丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系的建立 王新艳，张丹丹，桂月晶，李楠洋，徐 明，陈捷胤，戴小枫 （中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193 ） Verticillium dahliae ）致病性相关突变体的快速筛选体系，为突 摘要：【目的】建立适合于大丽轮枝菌（ 4 5 变库中与致病性相关突变体的系统筛选和鉴定提供技术支撑。【方法】棉花幼苗接种于 5.0×10、5.0×10 、5.0 6 7 8 ×10、5.0×10 和5.0×10 孢子/mL的孢子悬浮液30 min，通过病情指数调查明确引起棉花黄萎病发生的病原菌 浓度范围；对培养于培养瓶的大丽轮枝菌分别加入15、25、35和45 mL 的灭菌水，利用血球计数板检测洗脱的孢 子浓度，明确不同体积灭菌水对洗脱孢子悬浮液浓度的影响；以保存于96孔板的突变体为单位，在培养皿上进行 单孢分离并挑取单个孢子于培养瓶中扩繁培养，培养后于培养瓶中直接加入适宜体积灭菌水洗脱孢子，并将棉花 幼苗直接置于含有孢子悬浮液的培养瓶中处理 30 min，接种后继续培养 14 d 并调查结果；致病性相关突变体的 可靠性检验采用定量菌液蘸根接种法，每个突变体接种30株棉花幼苗，3个重复，孢子浓度为5.0×106 孢子/mL， 每株棉花幼苗按接种5 mL菌液计算，处理30 min，分别在第5、8、11和 14天调查病情指数。【结果】明确了适 合于大丽轮枝菌致病力快速鉴定的接种孢子浓度为＞5.0×105 孢子/mL；建立了大丽轮枝菌培养方法，单孢纯化培 养 5 d，培养瓶中扩大培养 9 d，确定了快速定量制备孢子悬浮液的洗脱体积为 25 mL，测试的 20 个突变体的洗 脱孢子浓度范围在（2.55±0.58）×106 7 —（1.72±0.25）×10 孢子/mL；优化了单孢分离、扩大培养、孢子悬浮 液制备、接种、继续培养和结果统计等环节，建立了大丽轮枝菌致病性快速鉴定流程，进一步统筹设计构建了大 丽轮枝菌致病性相关突变体快速筛选体系；测试表明该体系1人 1个循环共7个流程可完成1 344个突变体筛选， 周期 54 d，工作量为 21 人日；采用定量菌液蘸根法重复验证结果，突变体致病力同样显著下降，与快速筛选体 系的鉴定结果一致，表明该体系适用于大丽轮枝菌致病性相关突变体的快速筛选。【结论】通过棉花幼苗种植、突 变体单孢分离、扩繁培养、孢子悬浮液制备、接种、结果统计等环节的优化和标准化，构建了适合于大丽轮枝菌 致病性相关突变体的快速筛选体系，为后续致病相关基因的分离提供了技术支撑。 关键词：大丽轮枝菌；致病性相关突变体；致病性鉴定；快速筛选体系 Construction of a Rapid Screening System of Pathogenicity-Related Mutants in Verticillium dahliae WANG Xin-yan, ZHANG Dan-dan, GUI Yue-jing, LI Nan-yang, XU Ming, CHEN Jie-yin, DAI Xiao-feng (Institute of Agro-Products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricult