黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的高效分离与鉴定技术体系的构建.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(21):4496-4505 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.21.012 黑麦籽粒Waxy 蛋白亚基的高效分离与鉴定技术体系的构建 1 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 孟 敏 ，董 剑 ，高 翔 ，赵万春 ，李晓燕 ，陈其皎 ，陈良国 ，石引刚 1 2 （西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100； 陕西省小麦工程技术研究中心/ 陕西省小麦新品种培育工程研究中心，陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】构建用于制备级分离及高效鉴定黑麦籽粒Waxy 蛋白亚基的技术体系，为该亚基理化特性的分 析、功能的发掘及Waxy 种质的快速筛选等提供理论参考。【方法】设计特异引物从灌浆期间的奥地利黑麦籽粒cDNA 中克隆获得Waxy ，并进行体外表达；利用DuoFlow 对籽粒蛋白提取物进行纯化，对峰值收集物、原核表达产物及 其Ni 柱纯化的重组Waxy 蛋白进行SDS分离，挖取蛋白条带进行MALDI-TOF 质谱鉴定，结合经由基因序列所 推导的氨基酸序列，确定回收产物的Waxy 蛋白属性；在优化电泳条件的基础上构建针对Waxy 蛋白的毛细管电泳 体系；同时，利用部分黑麦品种对DuoFlow 及CE 体系的有效性进行验证。【结果】核苷酸序列分析表明，从奥地 利黑麦cDNA 中克隆获得一条覆盖Waxy 全长的编码序列（GenBank 登录号:KF559182），其理论编码产物约为60 kD； -1 利用DuoFlow Q1 阳离子交换柱，以低浓度Tris-Hcl （20 mmol·L Tris-Hcl，pH 9.5）进行蛋白挂柱，高浓度NaCl -1 -1 （20 mmol·L Tris+1 mol·L NaCl,pH 9.5）进行蛋白洗脱，214 nm 波长检测，实现了对籽粒Waxy 蛋白的DuoFlow 高效分离；纯化产物的SDS条带大小、质谱鉴定肽段与黑麦、小麦Waxy 蛋白序列相似性的统计结果表明， DuoFlow 峰值回收产物具有黑麦Waxy 亚基一致的特征序列，故属于Waxy 蛋白；以DuoFlow 纯化产物为标准样， -1 以0.05 mmol·L 硼砂+15%乙腈+1%SDS 溶液(pH 9.5)为缓冲液，采用分离电压20 kV，温度25℃，检测波长214 nm， 压力进样，0.5 psi×5 s，在11—12 min 处获得峰值约12 mAU 单一主峰，图形清晰，基线水平，从而构建了Waxy 蛋白的CE 鉴定体系，且籽粒Waxy 蛋白提取物能直接用于对该亚基的检测；同时，利用黑麦品种对上述体系的验 证结果表明，DuoFlow 及CE 体系适于对Waxy 亚基的高效分离与通量检测。【结论】从奥地利栽培黑麦cDNA 文库 中克隆获得Waxy 完整编码序列，构建了能特异分离黑麦籽粒Waxy 蛋白的DuoFlow 制备级纯化体系，并确立了黑 麦籽粒Waxy 亚基的毛细管快速鉴定体系。 关键词：奥地利栽培黑麦；Waxy 蛋白；毛细管电泳；DuoFlow 蛋白纯化系统；基质辅助激光解析电离飞行时 间质谱 Seperation and Identification Systems for Waxy Protein Originated from Rye (Secale cereale L.) Seeds 1 1,2 1,2