野生稻抗性候选因的筛选和克隆.pdf

野生稻抗性候选基因的筛选和克隆 摘要 本研究采用了茶陵野生稻、东乡野生稻、小粒野生稻等3个野生稻品种与部分可转 化大片段药用野生稻基因组文库等材料进行了野生稻抗性候选基因的转化与克隆研究。 研究主要结果如下： 1．东乡野生稻、小粒野生稻、茶陵野生稻等3个不同野生稻品种的总DNA电泳结果 表明，采用cTAB法提取野生稻总DNA可行，并且提取的DNA质量能够满足野生稻基因 转化与克隆及其他分子生物学分析要求；3个不同野生稻品种的总DNA分子量相差不大， DNA片段长度均在23KB左右； 2．选用9对引物分别对东乡野生稻、小粒野生稻与茶陵野生稻等3个不同野生稻 号为s2、As3)引物的扩增效果最好，主要表现为带型最清楚，非特异性扩增也最少。 因此，用第6对引物对茶陵野生稻总DNA进行扩增、回收、克隆及测序分析，初步得到 4类不同的抗性候选基因材料；用第10对引物对东乡野生稻总DNA进行扩增、回收、克 隆，得到34个阳性重组子； 3．在用wF一1、wR一1引物对茶陵野生稻总DNA进行PcR扩增的过程中，发现简并引 物的用量应该比普通特异性引物要高很多倍才能达到扩增的效果，通过1uL(12．5 “m01)、2uL(25um01)、4l上L(50um01)、8HL(100um01)、16uL(200um01) pL(200u 等5种不同简并引物浓度的实验，结果表明16 m01)的引物浓度的扩增效 果最好，其电泳带型最清楚，非特异性的扩增也最少，结果符合简并引物合成原则即简 并性要好且筒并性不能太高； 4．通过w卜1、wR一1引物对药用野生稻的可转化大片段基因组BIBAc2文库编号为 序列的同源性高达99．8％，并且与从茶陵野生稻里得到的4类抗性候选基因中的cLl7 那一类的同源性也高达99．6％。通过在NcBI网站里Blast搜索得知：它与粳稻第三号 染色体上的DP000009．1(GI存在高度的同源性； 5．同时通过实验我们还得知许多根据抗性基因保守序列设计的引物都能扩增得出 构建基因文库所用的BIBAc2空载体； 6．对药用野生稻可转化大片段基因组文库进行质粒转化到农杆菌LBA4404，得到 稻基因组片段在农杆菌LBA4404中能够稳定遗传。 关健词：野生稻；抗性；候选基因；筛选；克隆 from SelectionandCIoneofResistanceC粕didateGene WildRice Abstract：3Wild rice∞ong—xi髓g，xiao—H，Cha-ling)andpan usedilltllisresearchwllichw嬲aboutselec豳n large曲gmentlib脚了of0．簖cfM妇were on 廿le他sIlltsareasfollows： 柚dcloneresistaIlcec卸di出瞳e gene， 1．11le rcsult tocaIDNA agrosegelelec们phoresisofCha—ling，xiao—U，Dong—xi卸g t量le inmcateⅡlattlle ofCTABtodis虹llwildficetotalDNAtobefbasible，andof way quality totalDNAcaIl咧tlle cloneofthcwildriceando山ermolecuLar gcnc岫sfo咖ation锄d