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摘要 Smo siRNA对裸鼠食管癌移植瘤细胞凋亡影响的研究 硕士研究生：张虎 导 师：张红教授 陈奎生教授 郑州大学基础医学院病理学教研室 河南省肿瘤病理重点实验室 河南郑州450052 摘 要 在消化系统肿瘤中，食管癌是常见恶性肿瘤之一，对人类的健康和生命造 成了极大的威胁。其具有发病率高及发病隐匿、转移和死亡率高等特点。目前 临床上用于食管癌治疗的方法主要是外科手术治疗、化疗、放疗以及综合治疗， 尽管近年来各种治疗方法得以不断改进和完善，但食管癌患者的预后仍然较差， 为提高食管癌的疗效和改善患者的生存质量，寻求一种新的治疗方法是当前食 管癌治疗的研究热点。 Smoothened(Smo)基因是由3772bp构成的DNA序列，基因定位于染色体 来自细胞外的Hh信号转换为细胞内可识别的特异性转录因子Glil信号，进而 蛋白摆脱了Ptch受体的束缚，此时的Smo蛋白将向微管复合体上Fu和Cos2提 供磷酸基团促使Glil从复合体上脱离，此时的Gli蛋白转化成催化剂形式并以 全长的形式进入细胞核启动下游基因转录。 指结构，锌指间由组氨酸与半胱氨酸连接。Glil基因编码的产物Glil蛋白是特 异性转录因子，可将胞质内信号传递到细胞核，启动下游基因的转录，Gli基因 摘要 家族与果蝇Ci基因是同源基因，它们编码的蛋白质在Hh信号通路中起到关键 作用。 RNA干扰(RNA 度一般为2Int．23nt，siRNA再与体内的内切酶、外切酶和解旋酶等共同组成可 被RNA诱导的沉默复合物(RNA—inducedsilencing 激活ATP酶依赖的siRNA解双链过程。外源性、内源性基因编码的mRNA与激 活后的RISC在同源区域特异性的结合，在RISC的核酸酶功能的作用下，对其 迅速被降解。 现已证实Smo基因的高表达与多种肿瘤的发生有关，如：胃癌、结肠癌、 胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和基底细胞癌等。近期本实验室相关研究结果显示， 润深度、淋巴结转移密切相关；SmosiRNA可抑制食管鳞癌的浸润和转移。可 见Smo与食管癌的发生发展有关。 本研究采用不同浓度Smo 抑制效应最强的SmosiRNA序列、浓度和作用时间后，构建裸鼠食管癌移植瘤模 siRNA．1转染食管癌细胞72h后收集细胞，调节浓 型，即将浓度为250ng／}tl的Smo 度为1x107／ml，以裸小鼠背部肩胛旁区作为注射点，分别皮下注射0．2ml。采用 免疫组织化学及Westemblot技术检测各组瘤组织中Smo及Glil蛋白的表达；采用 组织原位杂交及RT-PCR技术检测各组瘤组织中Smo及GlilmRNA的表达；采用 TUNEL法检测细胞凋亡情况，采用透射电镜对凋亡细胞的超微结构进行观察， 为分子靶向治疗食管癌提供实验基础和理论依据。 材料和方法 1．人食管癌EC9706细胞株来自于中国医学科学院分子肿瘤学国家重点实 验室惠赠；Balb／c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。 Ⅱ 摘要 将此组细胞构建为裸鼠食管癌移植瘤实验组。 3．裸鼠食管癌移植瘤模型构建：将裸鼠分为3组，每组5只分别为：siRNA 干扰组、无关序列组和空白对照组，以肩胛下为注射点，分组皮下注射各组细 胞，构建裸鼠食管癌移植瘤模型。 4．采用免疫组织化学及Westernblot方法检测各组瘤组织Smo及Glil蛋白 的表达情况。 5．采用组织原位杂交及RT．PCR技术检测各组瘤组织Smo及GlilmRNA 的表达情况。 6．采用TUNEL法对各组瘤组织的凋亡状况进行检测。 7．采用透射电镜技术对裸鼠食管癌移植瘤细胞超微结果进行观察。 8．统计学处理：应用SPSSl7．0统计软件进行统计学处理，