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B7-1 单克隆抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应及分子机制研究 中文摘要 中文摘要 B7-1 是表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)表面的重要协同刺激 分子，其相应的受体是表达在T 细胞表面的CD28 家族分子。B7-1 与CD28 结合 是介导 T 细胞活化、增殖、分化及发挥免疫效应所必需的协同刺激信号。若缺乏 该信号，T 细胞将进入无反应状态（Anergy ）或免疫耐受（Tolerance ）甚至引起程 序性死亡（Apoptosis ）。 自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID ）是自身反应T 、B 细胞过度活化， 产生大量自身抗体，进而导致多系统、多器官受损的一类严重疾病。系统性红斑 狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE ）是其典型代表。目前研究发现，B7-CD28 协同刺激信号参与了 SLE 的发生发展，阻断或削弱该信号，可减轻此类疾患的病 理损伤。通过建立动物疾病模型模拟人类疾病的发生过程及临床表现是研究疾病 发生、发展、转归及寻找新的诊治途径的重要手段。本课题在建立慢性移植物抗 宿主病（cGVHD ）小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定的基础上，运用自 行研制的B7-1 单克隆抗体对疾病模型进行干预。通过免疫学、血清学及肾脏病理 损伤评价等指标考察抗体对疾病模型的逆转效应及分子机制。以期寻找新的对SLE 及相关疾患具有防治作用的特异、高效、低毒的生物制剂。 一、B7-1 单克隆抗体的制备及鉴定 目的：制备鼠抗人B7-1 单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用 体内诱生腹水法制备单抗；Protein G 免疫亲和层析法纯化抗体；流式细胞术分析 单抗对人及小鼠细胞膜型B7-1 分子抗原表位的识别。结果：经体内诱生腹水法制 备单抗，小鼠腹水形成阳性率约为80%，腹水收获量平均为3.5ml/ 只小鼠；经免疫 亲和层析法纯化，腹水中抗体蛋白的得率为3.2mg/ml ；B7-1 单克隆抗体与转人B7-1 基因小鼠成纤维细胞株L929-B7- 1 以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为99.3%及 65.4% 。结论： B7-1 单克隆抗体能够特异性识别相应的抗原分子。 二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定 目的：构建慢性移植物抗宿主病（cGVHD ）小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行 I 中文摘要 B7-1 单克隆抗体对小鼠狼疮样肾炎模型的免疫干预效应及分子机制研究 生物学鉴定。方法：将8 周龄雌性( C57BL/ 6 ×BALB/ c) F1 小鼠随机分为2 组， 7 造模组于0、3、7 和 11 d 经尾静脉注射亲代雌性BALB/ c 小鼠脾脏细胞10 /100 μL /只。正常对照组给予等量生理盐水。末次注射后第7 天，免疫荧光及流式细 胞术分析小鼠脾脏中巨噬细胞（CD11b+ ）、树突状细胞（CD11c+ ）、中性粒细胞 （Gr1+ ）及抗体产生细胞（CD21+等）的阳性百分率；每 2 周定期检测血清中抗 双链 DNA 抗体(ds-DNA) 、抗核抗体( ANA) 含量；每月定期检测尿蛋白含量。3 个月后处死小鼠，经 HE 染色观测肾脏病理变化，石蜡切片直接免疫荧光法分析 免疫复合物（IC ）的沉积以及透射电镜观察肾小球超微结构的改变。结果：造模 组小鼠脾脏中CD11b+、CD11c+及Gr1+细胞的百分率较对照组明显升高（p0.05 ）， 同时 B 细胞协同刺激分子 CD21+ 、CD23+ 、CD80+及 CD86+ 的表达上调明显 （p0.05 ）；建模2 周，70% 的小鼠血清中可检测到抗dsDNA 抗体和ANA，4 周时 达90% ；建模3 个月，70% 的小鼠出现蛋白尿，蛋白含量为++ ~ ++++ ；HE 染色及 镜下观察，出现肾小球肿胀及淋巴细胞浸润；直接免疫荧光法呈现大量IC 沉积； 透射电镜下可见造模组小鼠肾