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B7-2 单克隆抗体对狼疮样肾炎小鼠模型的免疫干预效应及分子机制研究 中文摘要 中文摘要 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE ）是一种由自身反应性免 疫细胞异常活化后产生自身抗体为特征的疾病。病变可累及全身，造成关节、皮 肤、肾脏、心脏、肺、血管等各脏器和组织不可逆的慢性破坏和功能丧失。其中 lupus nephritis ，LN ）是SLE 最常见也是最严重的并发症，是导致患 狼疮性肾炎 （ 者死亡的主要原因。该病的病因至今尚无明确定论，可能与遗传及环境等多种因 素有关。 B7-2 分子属于免疫球蛋白超家族成员之一，是抗原递呈细胞(antigen present- ing cell, APC)表面重要的协同刺激分子。其与表达于T 细胞表面的CD28 结合，介 导T 细胞活化、增殖、分化及发挥免疫效应。缺乏该信号，T 细胞将进入无反应 状态（Anergy ）或免疫耐受（Tolerance ）甚至引起程序性细胞死亡（Apoptosis ）。 研究发现，B7-CD28 协同刺激信号参与了SLE 的发生发展，并发挥着重要的作用。 B7 分子的特异性抗体可阻断或削弱B7-CD28 信号，从而抑制免疫应答，因此通过 应用B7-2 抗体阻断或削弱B7-CD28 通路有望为SLE 提供新的生物治疗方法。 本课题通过建立与人类SLE 疾病相似的慢性移植物抗宿主病（cGVHD ）狼疮 样肾炎小鼠模型。运用自行研制的B7-2 单克隆抗体对疾病模型进行干预，从免疫 学，血清学，肾脏组织形态学等方面的指标来考察抗体对疾病模型的逆转效应及 可能的分子机制。 一、B7-2 单克隆抗体的制备及鉴定 目的：制备B7-2 单克隆抗体并对其进行生物学特性鉴定。方法：应用本科室 成功建立的稳定分泌B7-2 单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D1，采用体内诱生腹水法 制备单抗；Protein G 免疫亲和层析法纯化抗体；流式细胞术分析单抗对不同细胞 膜型 B7-2 分子的识别。结果：经体内诱生腹水法制备B7-2 单抗，小鼠腹水形成 阳性率约为80%，腹水收获量平均为3ml/只小鼠；经免疫亲和层析法纯化，腹水 中抗体蛋白的得率为3mg/ml ；单抗与转人B7-2 基因小鼠成纤维细胞株L929-B7-2 、 Daudi 以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为99.3%、96.7%及61.2% 。结论：B7-2 I 中文摘要 B7-2 单克隆抗体对狼疮样肾炎小鼠模型的免疫干预效应及分子机制研究 单克隆抗体能够特异性识别不同细胞膜型B7-2 分子。 二、慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型的建立及病理性鉴定 目的：对慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型进行免疫学、血清学及肾 脏病理损伤鉴定。以考察该模型作为 SLE 疾病模型的可靠性。方法：将亲代雌性 BALB/c 小鼠脾脏细胞悬液经尾静脉注射( C57BL/ J6×BALB/ c) F1 代小鼠，每隔3 天注射 1 次，共4 次。建模后 1 周，采用免疫荧光及流式细胞仪分析小鼠脾脏中 抗原提呈细胞（APC ）及抗体形成细胞的百分率。每隔2 周检测血清中anti-dsDNA 抗体及ANA ；每隔4 周检测尿蛋白量的动态变化；建模12 周终止实验，取肾脏组 织作HE 染色观察病理改变，直接免疫荧光法检测免疫复合物（IC ）沉积以及透射 电镜观察肾小球超微结构变化。结果：流式细胞术的分析结果显示，造模后 1 周 脾脏中 + + + 膜型CD11b 、CD11c 及GR1 细胞的百分率较对照组明显升高（P0.05 ）， + 同时抗体形成细胞 B220 表面 CD21、CD23、 CD80 及 CD86 分子的表达均上调 （P0.05 ）；建模2 周时，血清anti-dsDNA 抗体出现阳性，4 周时ANA 出现阳性； 12 周时 80%的小鼠存在蛋白尿，蛋白含量++~++++ ；肾小球体积增大并有大量炎 性细胞浸润；肾脏IC 沉积；透射电镜下可见肾基底膜节段性增厚，脏层上皮细胞 和基底膜之间存在大量的电子致密