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郑州人学2006届硕士研究生论文cEA乳腺特异性表达载体的构建及其瞬时表达 cEA乳腺特异性表达载体的构建及其瞬时表达 硕十研究生： 袁云 导 师： 张钦宪教授 郑州大学医学院组织学与胚胎学教研室 郑烈 45∞52 摘 要 21世纪，癌症发病率和病死率持续增高，其已成为人类健康最大的威胁之 一。随着肿瘤学基础与临床研究的不断深入，从事肿瘤研究的专业人员们不断探 索新理论、新技术、新方法。癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，cEA)是一 种位于肿瘤细胞质膜表面的膜结合蛋白．是一种最常见的肿瘤相关抗原和目前国 际上公认的肿瘤标记物。CEA基因定位于19q13．1，13．2，有9个外显子8个内含 子，分子量约为180kDa，为免疫球蛋白超家族的成员。cEA有9个抗原决定簇， 是一种富含多糖的蛋白复合物，其中40％为蛋白质，60％为碳水化合物。其主 要在肝脏被分解。早期胎儿的胃肠管及某些组织细胞均有合成CEA的能力，孕 6个月以后，cEA合成量逐渐减少，出生后血中含量极低，但在不少恶性肿瘤患 者的血清中则可发现cEA含量异常升高。因此作为重要的监测指标，癌胚抗原 的监测在癌症治疗中被广泛应用，而癌胚抗原的肿瘤相关性也被多种肿瘤基因治 疗方案所采用。 CEA在很多腺体肿瘤中均能大量表达，与CEA相关的肿瘤如结肠癌、肺癌、 乳腺癌和胃癌等在癌症死亡中均占有很大比例。cEA对结直肠癌各期的敏感性 虽有不同，但总体来说可达40％～50％(特异性为95％时)，对胆管癌的敏感性也 可达50％左右，所以一般把CEA作为消化道恶性肿瘤，尤其是肠癌的常用肿瘤 标志物，并且它对肾、肺、乳腺、卵巢、子宫及其他许多器官的恶性病交也都有 较高的敏感性，因此在临床上又常常把它作为乳腺癌、胃癌及肺癌的第二标志物。 有CEA表达的肿瘤称为cEA阳性肿瘤，cEA阳性肿瘤在世界各地的发病 率都很高，是一类严重危害入类健康的常见肿瘤。目前，针对cEA阳性肿瘤的 发病机制，该类肿瘤的基因治疗越来越受到人们的重视。转基因动物是运用基因 工程手段，通过受精卵或胚胎干细胞的基因转移，姆外源重组基因稳定的整合入 郑州人学2006届硕士研究生论文CEA乳腺特异性表达载体的构建及其瞬时表达 动物的染色体，在动物体内得以表达并能遗传给后代的～类动物。转基因动物用 途众多，其在建立疾病和药物筛选的动物模型方面就有重要作用。制备转基因动 物的～个基本要求就是有能够表达的转基因动物构件，其基本组成部分包括调控 区、目的基因和polyA信号三部分。本研究中，使用已插入了乳清酸蛋自基因 (m廿)2．4kb启动子及其下游插入O．4kb polyA信号的可指导外源基因在乳腺 特异性表达的载体pwA，将克隆的目的基因2．1kbcEAcDNA连接于wAP启动 予和polyA信号之间，构建cEA乳腺特异性表达载体pwA．cEA，该载体就包 含了、W心启动子、CEA、poiyA三部分，即为转基因构件。构建成功的p、I‰CEA 成纤维细胞系，以地高辛标记的cEAcDNA为探针，采用原位杂交和免疫组化 技术检测CEA在两种细胞系中的瞬时表达，验证了pWA．c队表达载体的乳腺 特异性表达能力。 材料与方法： 1．载体pwA—cEA的构建：以含cEAcDNA目的基因的质粒pGEM4．cEA为模 板，设计引物(上、下游引物分别带有HindIII和xhoI酶切位点1，PCR扩增cEA 的cDNA片断；以HindIII和xho I对扩增产物进行双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳 回收2，1kb酶切片断。以Hindm和xho I双酶切质粒pⅥ，A，琼脂糖凝胶电泳回 收5．8kb酶切片断。T4连接酶体外连接2．1kbcEAcDNA目的片断和5．8kb pwA 质粒DNA片断，16℃，连接过夜。重组体转化感受念TGl细菌。将转化菌涂于 含AIIlp的LB培养皿上，37℃，培养过夜。随机挑选6个克隆，接种于含_^IIlp的