四价aβlt,1-15gt;基因工程肽疫苗对恒河猴的免疫原性及安全性评价.pdf

用恬项士论土 四价ABl-15基因工程肽疫苗对恒河猴的免疫 原性及安全性评价 硕士生 周 畅 导 师 姚志彬教授 学科专业 人体解剖与组织胚胎学 研究方向 老年性痴呆的免疫治疗 摘 要 老年性痴呆(AJzheimerdisease，AD)是好发于中老年人的一种中枢神经系 统退行性疾病，以记忆丢失及认知功能障碍为典型临床表现。主要病理改变为患 者脑内出现B．淀粉样蛋白形成的老年斑，神经纤维缠结及神经元丢失。随着研究 的深入，发现D．淀粉样蛋白(pamyloidpeptide，A13)在AD的发病机理中占据重 要地位。为此，以AB为靶的AD治疗方法成为新的亮点。1999年Schenk等在 NATURE杂志上首次报道用AB42全肽免疫治疗AD转基因动物模型。实验结果 显示，A1342全肽疫苗免疫不仅可诱导PDAPP鼠体内产生特异性抗体，而且可阻 止并减少鼠脑内AB的聚集。此后不断有研究表明主动免疫和被动免疫均能够清 除或抑制AD转基因模型鼠脑内的AB沉积，并明显改善其认知功能和行为学。 期临床实验中，因为有6％的接种对象出现了无菌性脑膜脑炎，实验被迫终止。 随后的尸检结论为：患者脑组织中存在T细胞和巨噬细胞浸润，由此可推断AB42 肽C末端的T细胞表位可能激发了Thl反应，从而诱发人体内T细胞的过度活 化并导致炎症反应发生。于是研究者不约而同着眼于既能避免T细胞介导的主动 免疫发生，又有效引发抗体生成的新型疫苗研究。且由于DNA重组技术的不断 创新，AD基因工程亚单位疫苗的研制成为研究热点。 目的 本研究利用基因工程方法制备的四价ADu5基因工程肽疫苗，配伍Th2型佐 剂MF59，免疫接种成年恒河猴，观察其体液和细胞免疫学效应以及安全性，为 用畅项士论支 四价ABus基因工程肽疫苗的临床应用提供实验基础。 材料和方法 1 疫苗的制备及接种 乳化成功，即为接种用疫苗，终浓度为200I_tglmL。 6只健康雄性成年恒河猴，随机分为2组，其中4×A6¨5组4只，未接种疫 5 苗组2只。每次均经三角肌内接受疫苗注射，每侧各0mL，200¨∥次，并分 别于第0、2、4、6周接受疫苗接种，共免疫接种4次。 2疫苗接种成年恒河猴的体液免疫效应观察 疫苗接种前l周采血1次，每次接种疫苗后2周采血1次，最后一次接种后4 周再次采血1次。每次采血量均为5mL。间接ELISA法检测恒河猴血清中抗Ap42 抗体的水平；桥联ELISA法检测血清抗邶42lgG亚类；免疫纽化法观察血清抗 Aft42抗体与AD转基因小鼠脑组织内的老年斑结合情况。 3疫苗接种成年恒河猴的细胞免疫效应观察 第4次疫苗接种后2周，采集恒河猴静脉血，分离外周血单核细胞(PBMC)， 5刺激对淋巴细胞的增殖 用4xA阢I5刺激培养的PBMC。3H—TDR法测定4xADl．1 4．疫苗接种成年恒河猴的安全性评价 观察记录疫苗接种后，恒河猴的全身状况以及接种部位的情况；于初次免疫 前1周及第4次疫苗接种后2周，分别检查恒河猴的血常规和肝肾功能；HE染 色观察疫苗接种后恒河猴的肝、脾的组织结构，六胺银染色观察肾小球基底膜的 形态结构；Perls法染色观察脑组织出血情况。 周怕颤士论吏 结果 1．疫苗接种成年恒河猴的体液免疫效应观察 第1次疫苗接种后2周检测，恒河猴体内没有抗体产生。第2次接种后2周， 部分恒河猴体内产生低滴度的抗体。第3次疫苗接种后2周，所有试验恒河猴血 液中均产生明显的抗A瞰2抗体(1：1760)，而且随着接种次数的增加，抗体的滴 度迅速升高。第4次疫苗接种后2周，抗体的平均滴度达到1：5600。第4次接种 后停止免疫，于4周后再次检测抗体水平仍维持在1：5400。 含量依次为IgGlIgG2IgG3[gG4，且IgG2／IgGll。 疫苗接种后，恒河猴血清中的抗A％抗体都能与T92576转基N4,鼠脑组织 内的AD斑结合。光镜下可见转基因小鼠脑组织内的Ap斑被染成棕色或棕褐色， 形态不一。 2．疫苗接种成