我国辽宁地区粘糖病ⅰ型患者的基因分析.pdf

中文摘要 目 的 f 为糖类多聚体，与蛋白质结合成蛋白多糖复合物，是结缔组织的主要成分。 它包括透明质酸(hyaluronic sulfate， cs)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate， Hs)和硫酸角质素(keratan sis type 床症状。根据病情可将MPS—I型分为重型(Hurler (Scheie syndrome，IS)和中间型(Hurler／Scheie 标准型MPS，我国也以该型居多。国外相关研究证明：MPS—I型是一种常 染色体隐性遗传病，其发病的根本原因是患者的IDUA基因发生了突变。 子。有人提出MPS—I型患者的不同症状是由不同的IDUA突变基因造成 的，IH型患者是重型突变基因的纯合子；IS型患者是轻型突变基因的纯合 子；而介于它们之间的中间型患者则是重型突变基因和轻型突变基因的杂 合子。迄今已发现IDUA基因各种类型的突变达60余种；近几年来我国台 北也报道了一些新的突变类型。但是我国内陆地区MPS—I型患者IDUA 基因的突变类型尚属未知。目前，我国对该病的研究仍旧停留在酶学诊断 水平，这是不够的。因为以往的研究表明：即使是正常人其白细胞中IDUA 活性也存在很大差异，而且部分正常人和携带者的酶活性很接近，。这样， 在没有先证者的情况下有时很难做出诊断。此外，有研究认为即使是MPS 开始从研究我国辽宁地区MPS—I型患者、携带者及部分正常人白细胞中 IDUA的活性入手，逐步深入地探究我国患者IDUA基因的多态性和它的变 异情况，与国外的相关研究结果做比较，分析它们的异同，并试图找到我国 MPS—I型患者IDUA基因的突变类型与其临床表现之间的关系，为指导优 生优育和将来真正意义上的基因治疗提供理论依据。 ／ ／方 法 ／ l 1．成色法测定患者及携带者白细胞中d—L一艾杜糖酶的活性： 反应液中加入20ul0．01mol／L的苯基一仪一L一艾杜糖苷，30ul缓冲液 中不加入苯基一d—L一艾杜糖苷。25℃孵育18h，加入酚试剂250td，4℃， 20分钟，使用722分光光度计测定光密度，波长660nm，读取吸光度。计算 酶活性，以izmoL／18h．mg．pro表示。· 2．荧光法测定患者及携带者白细胞n—L一艾杜糖酶的活性： D一葡糖二酸内脂24ul，白细胞匀浆24,,I，混匀，37。C ronide)24ul，5mmol／L 水浴1h。对照管以Triton代替细胞匀浆。用PH值为10的甘氨酸一碳酸 钠缓冲液760ul中止反应。使用960型荧光分光光度计，激发波长365nm， 发射波长450nm测荧光。计算酶活性，以nmol／h．nag．pro表示。 3．标本采集和基因组DNA的制备： 稀释后，用BECKMAN DU一600分光光度计测定O．D．值，波长为280nm及 ‘ ．2． 260nm，计算DNA的浓度及纯度。 4．PCR扩增IDUA基因外显子Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ： buffer 反应总体积为20ul，其中含2×GC 物各0．5ul，LA lul。 UNO—II。 PCR扩增使用仪器为Biometra 变： 外显子Ⅸ扩增产物进行酶切，反应体积为20ul，其中DNA扩增产物 xbuffer