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Pfh高保真酶介导的直接全皿检测耳聋摹冈突变热点的方法建就 中文摘要 Pfu高保真酶介导的直接全血检测耳聋基因 突变热点的方法建立 中文摘要 目的：利用全血PCR结合Pfu高保真DNA聚合酶介导的突变敏感性“分子开关” 技术建立先天性耳聋4个基因10个热点突变的检测方法。 方法：采集临床健康体检病人及诊断为神经性耳聋病人的血液标本，提取血液白 细胞中的基因组DNA，分光光度计测定其浓度；对健康体检病人的DNA样本的耳聋 基因GJB2、GJB3，SLC26A4、线粒体DNA热点突变所在的外显子进行PCR扩增并 测序，明确其基因序列，这些样本作为建立“分子开关”技术检测10个热点突变方 法的标准样本；构建10个位点的野生型和突变型质粒，作为检测的野生型和突变型 模板：根据该10个位点的突变特点，设计多对突变检测引物，通过实验选择产物特 异性高的引物作为突变检测引物；利用Pm高保真DNA聚合酶和3’末端硫化修饰 的突变检测引物对相应的野生型和突变模板进行扩增并测序验证扩增产物；优化PCR 扩增条件，提高“分子开关”对突变位点的识别能力。分别以基因组DNA和全血作为 DNA模板，重复上述检测步骤，尝试建立一种简化的PCR方法。将该方法用于20 例健康人及耳聋患者的热点突变检测。 结果：对不同的热点突变位点设计的多对突变检测引物，通过实验筛选到特异性 引物；在高保真DNA聚合酶介导的PCR反应体系中，3’末端硫化修饰突变检测引 物对突变模板扩增得到产物，对正常模板无扩增产物，显示“分子开关对耳聋基因 热点突变位点的特异性识别。 结论：成功应用全血PCR结合高保真DNA聚合酶介导的“分子开关”技术建立 了耳聋基因10个热点突变的检测方法；“分子开关技术是一种很有应用价值的点突 中文摘要 Pfh高保真酶介导的直接全血枪测耳聋基冈突变热点的方法建立 变检测技术，全血PCR方法也是一种值得推广的方法。 关键词：耳聋；高保真酶；全血PCR：基因诊断； 作 者：韩立影 指导教师：王进方琪 II Detect mutationsindeafness fromwholebloodPfuDNA Abstract hotspot genesdirectly by polymerase Detect mutationsindeafness from hotspot genesdirectly wholebloodPfuDNA by polymerase Abstract establisha accuratemethodtodetectten mutationsin objeetive：Tosimple hotspot deafness thewholebloodPCRandmutationsensitive”molecular utilizing switch”， genes mediated PfuDNA and modifiedallele byhigh-fidelity polymerasephosphorothioate specificprimers． blood fro