耐多药大肠埃希产ampc酶基因型研究及耐药性分析.pdf

目 录 1 耐多药大肠埃希菌产 AmpC 酶基因型研究及耐 药性分 析………………………………………………………………1 1.1 中文摘要………………………………………………………3 1.2 英文摘要………………………………………………………5 1.3 前言……………………………………………………………9 1.4 材料与方法……………………………………………………12 1.5 结果……………………………………………………………19 1.6 讨论……………………………………………………………28 1.7 结论……………………………………………………………33 1.8 参考文献………………………………………………………34 1.9 英汉缩略词对照表……………………………………………40 2 致谢……………………………………………………………41 3 （综述） …………………………………………………………………42 摘 要 目的：探讨本地区耐多药大肠埃希菌(Escherichia coli ，E ．coli)产 质粒 AmpC β-内酰胺酶（AmpC 酶）现状及其基因型分布，分析产 AmpC 酶大肠埃希菌对常用抗生素的耐药特点，为临床合理应用抗生素和防 止耐药基因的广泛传播提供理论依据。 方法：1. 初筛试验：根据临床实验室标准化机构 （Clinical labora-tory Standards Insitute, CLSI ）推荐的纸片扩散法 （kerby-Bauer 纸片扩散法）检测 71 株大肠埃希菌对头孢西丁的耐 药性，即抑菌环≤18mm 为可疑产 AmpC 酶阳性菌株。2.三维试验：根 据 Coudron 等推荐的头孢西丁三维试验方法，通过大肠埃希菌的β- 内酰胺酶提取物能否水解头孢西丁 （FOX ）来判定其是否产 AmpC 酶，从而检测出产 AmpC 酶菌株。3.纸片扩散法（Kerby-Bauer 法,K-B 法）：测定本地临床分离 71 株大肠埃希菌对头孢噻肟(CTX)、头孢吡 肟 （FEP) 、头孢西丁 （FOX) 、氨曲南 （ATM) 、亚胺培南 （IPM) 、 庆大霉素（GEN) 、阿米卡星（AMK) 、链霉素（S) 、环丙沙星（CIP ）、 左氧氟沙星(LEV)共 10 种抗菌药物的耐药性并筛选出产 AmpC 酶菌 株菌株。4.PCR 技术：检测三维实验阳性菌株的 AmpC 酶基因。参考 文献设计 6 对特异性引物，采用普通质粒小提试剂盒提取大肠埃希菌 质粒 DNA 用于 PCR 反应模板。各标本分别使用六对设计好的引物扩 增，阳性扩增片段长度分别为 520bp 、462bp 、405bp 、346bp 、302bp 、 190bp 。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线检测仪观察结果。5. 基因测序：分别取质粒 AmpC 酶基因扩增阳性的菌株的 PCR 扩增产 物用核酸定量仪测得 DNA 浓度300ug/ml,并送至上海生工生物技术 公司进行基因测序。 结果：1.头孢西丁三维试验：在 7 1 株大肠埃希菌中粗筛阳性产 AmpC 酶菌株共 11 株，通过头孢西丁三维试验分离出产 AmpC 酶的 菌株 8 株，占总菌株数11.27% 。2. 药敏结果：（1）7 1 株大肠埃希菌 药敏结果显示对亚胺培南全敏感，阿米卡星，头孢西丁，氨曲南，头 孢吡肟，敏感率较高均大于 59.15%，较低的是头孢噻肟，链霉素， 庆大霉素，环丙沙星，左氧氟沙星。（2）以耐多药菌株24 株（33.80%） 和双耐菌株 35 株为主（33.80% ），其中耐 多药模式的表型以 GEN+CTX+LEV (16 株，22.54%)为主。3.三维实验阳性菌株（产 AmpC 2 酶菌株）对多种常用抗生素的耐药率明显高于非产 AmpC 酶菌株 （χ 检验，P＜0.05)。4.PCR 检测 AmpC 酶基因情况：对三维实验阳性的 8 株菌株行 PCR 扩增，2 株呈阳性，测序