耐糖皮质激素的细胞淋巴瘤逃逸nk细胞免疫杀伤机制的研究.pdf

摘 要 研究背景 淋巴瘤（Lymphoma ）是一种淋巴细胞克隆性增生的淋巴造血系统的恶性肿瘤，B 细胞淋巴瘤占大多数，其治疗方案一直采用多药联合化疗及放疗。随着研究的深入，出 现了分子靶向药物美罗华，针对淋巴瘤细胞的特征性抗原进行靶向杀伤，淋巴瘤的治疗 效果得到明显的提高，但多药耐药淋巴瘤的治疗仍然存在很大的困难。近年来，异基因 造血干细胞移植和细胞免疫治疗应用于淋巴瘤的治疗当中，取得很好的疗效。 在异基因造血干细胞移植和免疫治疗中 NK 细胞一方面能够降低移植物抗宿主病 （GVHD ）的发生率，另一方面能够介导移植物抗白血病（GVL ）效应杀伤白血病细胞， 降低复发率，在机体抗肿瘤免疫机制中起到重要作用。有研究报道发生耐药的肿瘤细胞 能够逃逸NK 细胞的杀伤，成为肿瘤复发的根源。本研究应用药物地塞米松（DXM ）体 外诱导B 细胞淋巴瘤SU-DHL-4 （SU）细胞发生耐药，建立SU/DXM 细胞系，观察SU 细胞及发生耐药后 SU/DXM 细胞对NK 细胞杀伤敏感性的差异，并应用RT-PCR 、流 式细胞术等方法来研究分析其发生的分子机制。 目的 研究多药耐药的B 细胞淋巴瘤细胞逃逸NK 细胞免疫杀伤的分子机制。 研究方法 第一章 人B 细胞淋巴瘤细胞系SU 细胞和SU/DXM 细胞的生物学特性 用20µg/ml DXM 处理SU 细胞，直至其生长稳定。显微镜下观察SU 及SU/DXM 细胞的细胞形态、生长状态；流式细胞仪分析细胞周期分布；计数法绘制细胞生长曲线； MTT 法分析耐药谱及IC50 值。 第二章 NK 细胞对SU 细胞和SU/DXM 细胞的体外杀伤活性 提取3 例正常人外周血单个核细胞，流式细胞仪分选得高纯度NK 细胞作为效应细 胞，以SU 及SU/DXM 细胞作为靶细胞，采用CFSE 与PI 染色法用流式细胞仪检测效 靶比20:1 时NK 细胞对SU 及SU/DXM 细胞的体外杀伤活性。 第三章 SU/DXM 细胞体外逃逸NK 细胞免疫杀伤机制的初步研究 提取 SU 细胞和正常人外周血单个核细胞 DNA ；采用序列特异性引物扩增法 PCR-SSP 测定正常人NK 细胞KIR 基因型以及SU 细胞HLA Ⅰ类分子基因型。RT-PCR I 检测SU 和SU/DXM 细胞NKG2D 配体基因的表达情况。 结果 第一章 人B 细胞淋巴瘤细胞系SU 和SU/DXM 细胞的生物学特性 1．SU 细胞为圆形，呈悬浮生长，细胞体积较大。细胞周期检测比例如下： G0/G1 43.6% 、S 期 48.5% 、G /M 7.97% ； SU/DXM 细胞仍为悬浮生长，细胞周期中G /G 细 2 0 1 胞为50.9 ％，G /M 期细胞为 13.8％，S 期细胞为35.3 ％，G /G 细胞较SU 细胞增多。 2 0 1 显微镜下生物学特性没有明显改变。 2 ．耐药后的SU 细胞对DXM 、ADM 、L-asp 和Vp-16 的耐药倍数分别为耐药前的 8.59、3.64、2.98 和 2.61 倍，细胞对多种化疗药物耐药为多药耐药（MDR ）细胞，用 SU/DXM 细胞表示。 第二章 NK 细胞对SU 细胞和SU/DXM 细胞的体外杀伤活性 1．流式细胞仪分选的NK 细胞纯度大于90%，且细胞状态良好，活性大于95%， 能够满足实验需求。 2 ．CFSE与PI染色法检测杀伤，结果显示效靶20:1时，NK细胞对SU细胞的杀伤活 性为（25.45±3.21）% ，对SU/DXM细胞的杀伤活性为（11.42±2.43）% 。在同一效 靶比，NK细胞对SU细胞和SU/DXM细胞的杀伤活性组间比较差异均有统计学意义（P ＜0.05）。 第三章 SU/DXM 细胞体外逃逸NK 细胞免疫杀伤机制的初步研究 1．3 例正常