小檗碱对儿童肿细胞凋亡影响的实验研究.pdfVIP

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 小檗碱对儿童肿瘤细胞凋亡影响的实验研究 博士研究生 张小玲 导师 胡群 教授 周木想* 教授 中文摘要 第一部分小檗碱对儿童肿瘤细胞增殖、凋亡的影响 及其分子机制研究 目的： 癌基因双微体2 (Murine Double Minute 2 ， MDM2)在肿瘤发生、发展和化疗耐 药性产生过程中发挥重要作用。本实验室前期的研究表明，组成性高表达MDM2 的 急性淋巴细胞白血病和神经母细胞瘤患者的预后往往较差。我们初期的研究显示， 小檗碱能特异性下调肿瘤细胞MDM2 表达。MDM2 具有E3 连接酶活性，当MDM2 与DAXX 和HAUSP 处于结合状态时，作为E3 连接酶的MDM2 泛素化并降解肿瘤 抑制子p53 。而当MDM2 与DAXX 和HAUSP 处于分离状态时，作为E3 连接酶的 MDM2 泛素化并降解MDM2 自身，从而激活p53 。因此，本研究的目的： 1. 小檗碱对儿童肿瘤细胞增殖、凋亡的影响； 2. 小檗碱对儿童肿瘤细胞MDM2 、p53 表达影响及其分子机制； 3. 小檗碱是否具不同于传统化疗药物阿霉素抗肿瘤作用机制，即是否通过抑制 DAXX 下调癌基因MDM2 表达。 *Prof. Muxiang Zhou: Pediatric Hematology/Oncology Emory University School of Medicine, Georgia USA. 2 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 方法： 1. 选取 20 种儿童急性淋巴细胞白血病细胞系为研究对象，用WST 方法 检测不同浓度的小檗碱对 20 种ALL 细胞系生长抑制作用，并比较分 析小檗碱IC 5 0 与 MDM2 、p53 表达状态之间的关系。 2. 选取对传统化疗药物阿霉素耐药的ALL 细胞系EU-1 、REH 和神经母 细胞瘤细胞NB-1691 和NB-1643 为模型。用Western-blot 方法检测 不同浓度和不同时间条件下小檗碱作用细胞后，MDM2 、p53 、Bcl-2 等相关蛋白表达的变化。 3. 选取对传统化疗药物阿霉素耐药的ALL 细胞系EU-1 为模型。用RT- PCR 方法检测小檗碱以相同浓度处理不同时间条件下细胞MDM2 、 p53 、p21 、PUMA 、GAPDH 等相关基因mRNA 表达变化。 4. 选取对传统化疗药物阿霉素耐药的ALL 细胞系EU-1 为模型。用 Western-blot 方法检测小檗碱以不同浓度处理24h 条件下EU-1 细胞 p53 及其下游靶基因p21 、PUMA 、GAPDH 等蛋白表达变化。 5. CHX （内源性蛋白合成抑制剂）作用于细胞后，用Western-blot 检测 小檗碱作用于EU-1 、UOC-B1 细胞前后MDM2 、p53 、Bcl-2 蛋白 半衰期变化。 6. 选取对传统化疗药物阿霉素耐药的ALL 细胞系EU-1 为模型。用 Western-blot 方法检测小檗碱以不同浓度处理24h 条件下EU-1 细胞 凋亡关键蛋白酶 caspase 3 及其底物 PARP 是否被剪切。 7. Western-blot 方法检测 8 种（其中包括4 种ALL 细胞和4 种NB 细 胞）细胞系DAXX 、 MDM2 、 HAUSP 蛋白组成性表达, 小檗碱处理 前后DAXX 、 MDM2 、 HAUSP 蛋白变化；比较分析以上蛋白表达