体外新生大鼠海缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及ca-ak通道在自噬中的作用机制.pdf

体外新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及Ca-A/K通道在自噬中的作用机制 中文摘要 体外新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达 及Ca-A/K通道在自噬中的作用机制 中文摘要 目的：通过观察体外新生大鼠缺氧缺血性损伤模型，了解海马神经元的损伤情况， 以及损伤后不同时间点及各组间细胞自噬变化和Ca-A/K通道亚基情况，探讨自噬抑 制剂3-methyladenine （3-MA）对自噬调节及对细胞存活的影响，并初步研究缺氧缺 糖后Ca-A/K通道亚基变化与自噬的关系。 24 SD SpragueDawley 方法：采用新生 小时以内的 （ ）大鼠进行海马细胞原代培 养，行氧糖剥夺(oxygenglucosedeprivation，OGD)的处理方法，模拟神经元缺氧缺血 0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h Western 模型。选取氧糖剥夺后 、 、 、 、 、 、 七个时间点，通过 blot RT-qPCR LC-3 Beclin-1 及 法测定氧糖剥夺前后海马神经元自噬相关蛋白（ 、 ）、 mRNA 的变化和Ca-A/K通道亚基 （GluR1、GluR2、GluR3）的蛋白变化；透射电镜 下检测自噬的特异性结构；用CCK8法检测细胞活性，采用Fluo-3AM流式检测缺氧 2+ 缺血后[Ca ]i 的水平变化，应用自噬抑制剂3-MA干预后，行上述检测，初步探讨自 噬和Ca-A/K通道的关系及可能机制。 结果： 1、电镜结果显示，相比正常条件下的神经元，缺氧缺糖后神经元细胞浆内有大 量自噬体形成；预先采用3-MA干预的细胞组也有自噬体形成，但比缺氧缺糖组明显 降低。 2 RT-qPCR 0.5h 1h LC3 Beclin-1 、 结果显示，与对照组相比，缺氧缺糖组 和 组 、 均表达上升，缺氧缺糖0.5h组在0h表达就开始上升，48h达到高峰后开始下降。缺 1h 72h 0.5h 3-MA 氧缺糖 组则 达到高峰后下降，且比缺氧缺糖 组表达量增高； 干预 1h组则在模型后6h就呈现下降，12h趋向正常水平。 3、Westernblot结果发现，与对照组相比，缺氧缺糖0.5h组和1h组LC3、Beclin-1 0.5h 6h 48h 1h 均表达升高，缺氧缺糖 组在 达到高峰， 后开始下降。缺氧缺糖 组则 I 中文摘要 体外新生大鼠海马缺氧缺血模型中自噬相关分子的表达及Ca-A/K通道在自噬中的作用机制 12h达到高峰后呈现下降趋势；且比缺氧缺糖0.5h组表达增强，3MA干预1h组在6h 后呈现下降趋势；缺氧缺糖 1h组的GluR1、GluR3在缺氧缺糖后6h表达上升，持续 24h GluR2 6h 24 到 后下降，而 则在 表达下降，持续到 恢复正常水平。 4、CCK8结果显示，缺氧缺糖损伤恢复正常条件24h后细胞存活率为71±1%， 48h存活率为80±4%，相应的在每个时间点给予3-MA预处理后细胞存活率分别为 75±5%、82±4%，无显著性差（p0.05）。 结论： 1．