第二章生物化学技术原理及其应用-资料.pptVIP

生物化学技术原理及其应用 习 欠 云 动物科学学院 2006，9 原理？ 是什么和为什么的问题！ 基本理论： 样品制备（前处理） 有效成分的分离（粗分级） 纯化与鉴定（细分级） 第一章 生命大分子物质的制备 目的 获得纯的和比较纯的生命大分子物质. 第一节 材料的选择 有效成分： 是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质；而有效成分以外的其它物质则统称杂质。 1．动物脏器? 冰冻 干燥 (1) 冰冻： 从刚宰杀之牲畜得到的脏器要迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净，若不马上抽提、纯化时，应在很短时间内 (25℃时)置-10℃冰库(可短期保存)或-70 ℃低温冰箱(数月不变质)贮存。 2．植物组织 若是叶片,用水洗净即可使用，或在10小时内置-4 ℃一-30℃冰箱贮藏备用； 若是植物种子，则须泡胀或粉碎才可使用。如材料含油脂较多时，也要进行脱脂处理。 ? 3. 微生物 特点： 种类多、繁殖快、培养简便、诱变容易和不受季节影响; 在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量. 第二节? 细胞的破碎 机械破碎； 溶胀和自溶； 化学处理； 生物酶降解. 一、机械破碎 1）用研磨棒研碎组织,可加入一定量的石英砂(45—50u)。 2）用匀浆器处理 优点：此法较温和，适宜实验室应用注意：加石英砂时，要注意其对有效成分的吸附作用。如系大规模生产时，可用电动研磨法。细菌和植物组织的细胞破碎均可用此法。 二、溶胀和自溶 细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。 例如：红血球置清水中会迅速溶胀破裂并释放出血红素。 三、化学处理 用脂溶性的溶剂(如丙酮、氯仿、甲苯)或表面活性剂处理细胞时，可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类等物质，并导致整个细胞破碎. 如细胞裂解液。 四、生物酶降解 生物酶(如溶菌酶)有降解细菌细胞壁的功能。用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。 例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，不少方法都采用加溶菌酶(来自蛋清)破细胞壁的步骤。 第三节 抽 提 指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来和去除杂质的过程. 1.可用缓冲液，或稀酸、稀碱、有机溶剂(如丙酮、乙醇)等溶液抽提； 2.还可用蒸馏水抽提； 3.全蛋白质组抽提试剂盒. 1、pH值 对具有等电点的两性电解质物质，抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内. a.碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提； b.酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提； c.用调至一定pH值的有机溶剂抽提. 2、溶剂的极性和离子强度 有些蛋白质或酶在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。 3、水解酶 在抽提、纯化蛋白质或核酸时，其效果常常受到本身存在的水解酶的影响。这些酶在与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。 必须小心地采用加入抑制剂(苯甲基磺酰氟化物．简称PMSF)或调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性。 4、温度 蛋白质或配制品在低温(如0℃左右)最稳定； 如在生产人绒毛膜促性腺激素(HCG)制品时，一定要在低温下进行； 从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶正好相反。它对低温敏感，25℃时才稳定。 5、搅拌 能促使欲抽提物与抽提液的接触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，致某些酶类变性失活。 6、氧化 一般蛋白质都含有相当数量酶和蛋白质的必须的巯基，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶(或蛋白质)失活(或变性)． 7、金属离子 蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和来源于制备缓冲液的试剂中的金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。 解决的办法： 用无离子水或重蒸水配制试剂； 在配制的试剂中加1-3mmo1/L EDTA(金属离子络合剂)。 8、抽提液与抽提物的比例 在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以5:1为宜。 如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。否则反之。 第四节 浓 缩 抽提液的体积若比较大，应先进行浓缩处理。 方 法： 一、沉淀法 二、吸附法 三、超过滤法 四、透析浓缩法 五、减压蒸馏浓缩法 六、冰冻干燥法 第五节 纯化方案的设计与评价 纯化方案——指在纯化过程中几种纯化方法有机的联合应用的总称。 它是成功地达到纯化目的的前提。纯化方案合理，就能事半功倍。 一、纯化方案的设计 依据：从抽提液中有