抗人可溶性间皮相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定.pdfVIP

中文摘要 抗人可溶性问皮素相关蛋白单克隆抗体的制备 及特性鉴定 摘 要 常间皮细胞以及间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌等恶性肿瘤中识别 框，编码M，69000多肽。间皮素的前体蛋白由628个氨基酸 组成，含有4个糖基化位点，其中的一个或多个位点发生糖 000和31 基化后，间皮素及被furin蛋白酶水解为M，分别为40 000的两个片段，其中40000的片段通过糖基磷脂酰肌醇 000的片段脱落，称为巨核细胞集落刺激因子 (megakaryocyte．potentiatingfactor，MPF)。间皮素转录结构中 的两个次级连接的存在使间皮素基因编码蛋白含有两个异 构体，异构体2在翻译过程中保留了第16个和第17个外显子 中间的内含子，造成翻译过程中的框移突变，蛋白翻译提前 中止，使其从细胞表面脱落形成可溶性间皮素相关蛋白 mesothelin—related (soluble 000～45 000的NH2末端氨基酸序列，与间皮素的膜连接部分 完全相同。SMR可以间皮素阳性肿瘤细胞的培养上清中及问 皮素阳性肿瘤患者的腹水、血清中检测到，从而使之有可能 成为新的恶性肿瘤监测指标。但到目前为止，国内仍无抗 一目的，本研究中选择性合成了鼠抗人SMR的多肽制备了单 中文摘要 克隆抗体(mAb)，并对其生物学特异性进行了鉴定。 Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数、B一转角等 多参数分别进行预测，然后用吴氏法进行综合分析其准确 性。 2抗SMR抗体的制备应用方法1选取的SMR抗原表位的 氨基酸序列，合成多肽抗原，免疫BALB／c小鼠，取脾细胞 与SP2／O小鼠骨髓瘤细胞融合后，选出抗SMR抗原表位的 阳性克隆，再进行亚克隆，将稳定分泌抗SMR抗原表位单 克隆抗体的细胞株进行扩大培养。抗体效价用ELISA法检 测。取～定量杂交瘤细胞给BALB／c小鼠腹腔注射，约两周 后收集腹水，得到高效价抗SMR抗原表位的IgG，应用免疫 blot分析等方法对抗体进 细胞化学、SDS．PAGE和Western 行特异性鉴定。 3mAb的效价、亚类及特异性鉴定 000稀释包 3．1效价测定：利用SMR复合肽抗原(1／Mg／mL)1：1 被微孔板，利用ELISA法检测腹水抗体效价。 3．2抗体亚类测定：用mAb亚类分型试剂盒，按试剂盒说明 书操作。用PH7．2．7．6PBS稀释鼠抗SMR单克隆抗体，稀释 度为1：20000。取15吮l稀释好的SMR单克隆抗体放入试管 中，混匀，室温孵育30分钟。试管中插入试剂条反应5分 钟，观察结果。 3．3特异性鉴定：(1)免疫细胞化学(SP)法检测单克隆抗体与 问皮素阳性卵巢癌细胞表面天然蛋白反应性。盖玻片常规浸 酸、冲洗、高压灭菌后，放置于无菌6孔培养板中。选择经 中文摘要 证实表达问皮素的处于对数生长期的人卵巢癌细胞系 3％过氧化氢室温孵育30rain，以去除内源性过氧化氢，蒸馏 水冲洗，磷酸盐缓冲溶液冲洗5minX3次，10％山羊血清封 闭非特异性抗原20min，加入小鼠抗人间皮素抗体2H10或 min；加入辣根过氧化物酶标 标记的羊抗鼠IgG，37。C孵育30 记的链霉素，自来水停染，苏木精复染，中性树胶封片。对 Blot分析制备的单克隆抗 照组用PBS代替一抗。(2)Westem 体与间皮素目的蛋白的反应性。从上述卵巢癌细胞中提取总 蛋白质后，按考马斯亮蓝试剂盒说明测定蛋白质浓度，取 5陬g总蛋白质加入等体积(2×)上样缓冲液上样，SDS一聚丙烯 V电 酰胺凝胶电泳分离，先80V电泳30min，后转为120 泳90 min。根据标准分子