it15基因片真核表达载体的构建及其功能研究.pdf

浙江大学颧士论文 摘要 I鬻重5基因片段真核表达载体的构建及其功能研究 浙江大学医学院 神经病学 2004级硕士研究生 田均 导师 张宝荣教授 中文摘要 disease，HD)：一种常染饱体盥性遗传 【背景与目的】亨徽顿舞蹈病(}{untin科on 的神经交往疾病。临床表现为慢性进行性舞蹈样不自妻运动、精神障碍及痴呆， 多在孛老年发瘸，麓瘸鑫l罄∞宰死亡。至今尚纛有效戆治疗方法。该瘸静致瘸 基因为rrl5基因，rrl5基因l号处显予内含蠢一段多态性鲍三核营羧(CAG)震 复序列，当CAG重复拷贝数大予37次时引起发瘸。rI_15基因编码～N端含有多 Htt)。}糙神经瘸莲改变主要在基赢节稻大脑度滋，尾袄核教壳棱受累鼹严重。 痣变区域凑神经元竣蠹聚嶷貔(agg豫gates)靛形成是}粉戆圭零癔毽特鬣。该菝 内聚集物主要是由变异Hc￡的N端片段形成。有研究表明对神经元的毒悭作用主 入rrl5基因l号外显子的转基因小鼠袭现出勾HD瘸入类似的瘸理特征及临床袭 型。交雾融静N端笄菠如侮入投并在梭蠹澎或聚集耪满不清楚。畿近育研究发 现H瞧贻豹17个氨蒸酸爨与核我蛋是{寥绺勰幽蹦聪爹∞m凇辑踟垮稳互终爝 从而介导Htt的N端片段的出核，丽异常扩增的PolyQ能减弱这釉相甄作用导致变 异Htt在竣内聚集。m)选择性引起神缎元死亡的机制不清楚，可能与氧化应激、 线粒体功能异常、凋亡、能董代谢障褥、兴奋性中毒有关。而这一系列细胞瓣 瀑江大学壤±论文 攮饕 性事件的起始事件可能燕变异Hlt的N端片段入核后与一系弼转录因子壹接或间 接作用导致细胞基因转录异常，引起丰申经元死亡。商研究发现变异Hrt能够与转 录共激溪因子CBP晦缀蛋自乙酸基转移酶豹功栽域结合从褪掷制其瓣性，醛低 组蛋白H3和H4艺酰化的水平。缎蛋自乙酰亿水平的高低决定了染色体稻应区域 内基腿转录水平的离低。蕊缀蛋白的乙酰化水平爱缎蛋白乙酰基转移酶(His的ne 因此通过抑制瑚)AC的活性来平衡HD细胞降低了的组蛋白乙酰亿水平从而来 逆转胁缨腿改变了的基圜转录成为治疗醐)新的靶点。如AC抑制荆丁酸钠被发 现在}国架螭和转藜因小鼹模型中稳能够廷缓疾瘸熬进程。然蠢丁酸镑是否姥煮 接针对HD细胞起作用阻断病变细臌的死亡，目前未见有报道。 我们在临床上发现一翔)大家系，并缝基因诊断明确该家系内HD患者的Ⅱ5 蒸因的cAG重复拷灸数均大于50次。我们撅逶迸基疆重组救零梅建该家系两}彩 患者的Ⅳ15基因片段真核表达载体，转染神经元细胞SH．SY5Y缅胞和jE神经元 }la缨臌，表达变异№媳N端片段模拟}彤的发瘸，建立HD细胞模型，为进一 步研究HD酌发病税制奠定萋磴。瓷缅耱水平上磷究丁黢铺瓣于}∞鹣傈护捧瑗。 初步探讨H椭勺N端片段的出核转运机制。 【材料与方法】蟊}究对象寒蜜一个浙江省连续4代发痍的HD家系。选择该家系 肉一cAG重复祷受数高速68次的意者及eAG耋菱拷灵数为17次数正常入，播撬 子我l一53令密鹦予，计数以禽毒17个逮续CAG重复拷贝的娌15基因为撂准)， 将PCR扩增的甜的片段装入pEG砖一cl，椅建GFp二Htt—19Q(努妻鏊)、 元缨糍№la缓耱。荧光爨微镜鼹察变异珏￡浓s＆sY5Y缨骢彝№la缨胞内的分带 定位及聚集情况。West蝴Biot证实撇静潲片段在瞬时转染GI骨·壬l琏一19Q、 嵇碧硎t孵oQ豹s捧SY5Y缁愿静潘缨艟数及流钱纲鼹零计算s球sY5Y缨飘瑟 亡率研究变异Htt对神经无细胞的毒往作用及丁陵铺的保护作用。瞬时转染 激江大学磺士论文 域2小时艨，荧光显微镜观察目的骚自的豫细胞定位改变。掏建下列真核液达载 个密码予)。将上述震粒转染l纛缍憨，焚建显微镶理襄袋失壬毛援起始1个懿基酸 细胞定位。 【结果】成功构建{T15基因片段真核寝运载体GFP·H挝．19Q(野生搿)、 主要分布予SHsY5Y细胞和Hela细胞的胞质中，部分变异Htt的N端片段入核