采用载体介导的irna抑制非小细胞肺癌表皮生长因子受体表达的实验研究.pdfVIP

第一部分质粒介导的siRNA抑制肺腺癌细胞株EGFR的表达 【摘要】目的探讨质粒介导的短发夹RNA(shRNA，shortRNA) hairpin adenocarcinomacell 表达载体对人肺腺癌细胞株(human lines， lung factor HLAC)中表皮生长因子受体(epidermalgrowth receptor，EGFR)表 达的抑制效应。方法①构建靶向EGFR基因的shRNA质粒表达载体 A549和SPC．A1中，Real—timePCR检测EGFR mRNA表达变化；免疫 荧光、流式细胞仪、Westernblot检测EGFR蛋白水平变化。结果成 功构建pShEGFR，并通过测序证实。转染后2d，pShEGFR对A549 和SPC—A1中EGFR 白抑制率在转染后6 中下调EGFRmRNA和蛋白水平的表达，为采用载体介导的siRNA用 于靶向EGFR的抗肿瘤研究提供了可能。 【关键词】质粒；短发夹RNA：表皮生长因子受体；人肺腺癌细胞株 第二部分靶向EGFR的siRNA对肺腺癌细胞株生物学行为的影响 SPC—Al细胞增殖、凋亡、迁移及药物敏感性的影响。方法①利用 成实验观察细胞生长变化；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡；Millcell 小室检测细胞迁移；MTT法检测细胞对顺铂、阿霉素、泰素的敏感性。 6．4倍。结论 阿霉素、泰素的敏感性分别提高6．7和6．0、5．5和4．7、6．65E1 靶向EGFR基因的shRNA质粒表达载体能够通过下调EGFR蛋白水平抑 制肺腺癌细胞生长、迁移、促进细胞凋亡，并提高细胞对不同化疗药 物瓶敏感性。 三耋键词域皮生长因袋慨短发夹y：人肺腺癌矽株’生长今 凋亡 p ∥ 第三部分 靶向EGFR的siRNA重组腺病毒载体抑制肺腺癌生长的体 内实验研究 【摘要】 目的体内试验验证重组腺病毒载体介导的siRNA是否能有 效下调HLAC中EGFR表达及其抗肿瘤效应。方法①构建表达针对 EGFR的shRNA穿梭载体，将穿梭载体和骨架载体共转染293包装细 HLAC．A549和SPC—A1，Real．timePCR检测EGFR基因mRNA表达变 化：免疫荧光、Westernblot检测EGFR基因蛋白水平变化。⑨体外感 染病毒后的HLAC进行动物接种，测量肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线， 记录肿瘤重量，计算肿瘤抑制率。④建立荷瘤鼠模型，瘤内注射 Adv．shEGFR，测量肿瘤体积绘制生长曲线，记录肿瘤重量，计算肿瘤 blot测定肿瘤组织的EGFR蛋白水平； 抑制率。利用免疫组化和Western 免疫组化检测肿瘤组织中PCNA水平：TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡 白表达的抑制率分别为62．8％和52．4％，并明显抑制肿瘤的生长。结论 表达并有效抑制HLAC的体内生长，为开发基于RNA!技术的抗肿瘤 药物提供了理论依据。 【关键词】表皮生长因、乇受体；短发夹RNA；腺病毒载体；肿瘤基因 …、．，，． K X 一 治疗；体内 V ABSTRACT PartI： of factor Downregulationepidermalgrowth receptorby smallinterferenceRNAinhuman