正交设计优化草地早熟禾SRAPPCR反应体系及引物筛选.pdfVIP

卷 期 草 业 科 学 正交设计优化草地早熟禾 反应体系及引物筛选 任小巍 王 瑜 袁庆华 兰州大学草地农业科技学院甘肃 兰州 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京 摘要采用 正交试验设计方法对草地早熟禾 基因组 反应体系中的 聚合酶 引物及 四因素的用量进行优化并比较不同模板 用量对扩增的影响建立草地 早熟禾 最佳反应体系同时利用该体系对 引物进行筛选结果表明草地早熟禾 最佳反应体系为 聚合酶 引物 模板 总体积 运用该体系从 对 引物中筛选出 对引物能够 产生清晰稳定的扩增条带且多态性丰富优化体系的建立及引物的筛选可为今后利用标记技术对草地早 熟禾进行遗传多样性分析图谱构建种质资源鉴定奠定技术基础 关键词草地早熟禾 标记正交试验设计引物筛选 中图分类号 文献标识码 文章编号 相关序列扩增多态性 为草地早熟禾 分子标记研究奠定基础 简称 是 年由 材料与方法 和 在芸薹属 中首次应用的一种 供试材料 试验所用的 份草地早熟禾材料 基于 的分子标记技术该标记针对基因启动子 表 由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草 与内含子中胸腺嘧啶腺嘌呤含量丰富而外显子中 种质资源研究室提供 体系优化的 胞嘧啶鸟嘌呤含量丰富的特点设计特定引物进行 模板来自巴林引物由上海生工生物工程公 扩增反应因不同个体启动子内含子与间隔区长度 司合成 和 聚合酶为 产品 不同而使扩增条带产生多态性标记具有简 表 供试材料的名称与来源 便稳定产率中等以及在基因组中分布均匀等特 点 已被广泛应用于种质资源遗传多样性分 序号 供试材料 来源 析 遗传图谱构建 比较基因组学 重要性 状基因标记 等方面 肯塔基 美国 草地早熟禾 为冷季型草坪草 公园 美国 具有绿期长色泽翠绿质地均一柔软等优点在全 午夜 美国 世界 温带 地 区广泛种植 目前 巴林 荷兰 分子标记技术在草地早熟禾研究中均有 应用而 标记方面的研究 目前尚未见报道 试验方法 基因组 的提取与检测 以苗期草地早 本研究首次利用正交设计对草地早熟禾 反应体系进行优化并利用所得最佳反应体系对 熟禾叶片为材料采用改进的法 提取基因 引物进行筛选以获得草地早熟禾最佳 组 通过 琼脂糖凝胶电泳检测提取 的质量并以一定浓度的 作为定量参照 反应体系和多态性丰富的引物组合以期 收稿日期 接受日期 基金项目国家十二五支撑项目 作者简介任小巍 男河北张家口人硕士主要从事牧草种质资源研究 通信作者袁庆华 标准稀释样品 浓度至 表 正交试验设计 保存备用 反应体系正交试验设计 采用 因素 正交试验设计对 聚合酶 引物及 编号 引物 进行 因素 水平筛选表 表 所用引 聚合酶 物为 和 组合表 在 反应 体系中含有 和 模板 其余各成分含量按表 进行制备 表 体系的因素和水平 因素 水平 引物 聚合酶 用 组合模板 用量设置 个梯度依 次为 引物筛选及优化体系的应用 依据上述试验 扩增程序 预变性 变性 结果确定的最佳反应体系以巴林基因 退火 延伸 个循环 组 为模板对供试的 对引物组合表 进 变性 退火 延伸 行筛选从筛选得来的引物中随机选取 对引物组 个循环循环结束后 延伸 保存 合对 份草地早熟禾种质材料进行多态性验证 扩增结束后取 产物与 结果与分析 混匀点入含 的 正交试验扩增结果分析 依 琼脂糖凝胶中在 电压下电泳 电 据谱带的数量及强弱将 反应体系 个 泳结束后将凝胶置于紫外凝胶成像仪中观察照相 组合的扩增结果由好至差依次排列为 模板 用量优化 应用正交试验筛选出 图 和 五个组合条带数量过 的最佳组合对模板用量进行优化引物选 少 不宜采用 四个组合条带均较多经仔 表 引物序列 编号 正向引物 编号 反向引物 草 业 科 学 第 卷 期 表 正交试验结果的统计分析 项目 引物 聚合酶 图 正交设计 反应体系扩增结果 模板 用量的确定 由于模板 的 用量不同草地早熟禾 扩增结果存在较 大差异图 当模板 用量过低 或 注 为 为表 处理组合编号引物为 和 组合 过高 时条带数量很少或几乎无条带当 模板用量为 时条带数量多且清晰稳定 各处理间均匀一致说明 扩增模板 浓 细比较后发现组合 的条带数量最多且清晰度高 度适应范围较宽此 个处理基因组 用量平 因此选择该组合为草地早熟禾 的最佳 均为 而在 条件下扩增条带清晰无杂 反应体系即 因素用量分别为 聚合酶 带因此最终确定 体系中模板 的含 引物 量为 总体积 引物筛选及验证 利用优化好的 参照张丽等 的统计方法对 个组合正交试 反应体系对供试的 对 引物 验结果进行分析表 其中 代表该因子在某水 平下参与反应所扩增出的总条带数 代表该因子 在