第五章生物技术讲解.pptVIP

（一）花粉植株的形态发生方式 1、器官发生型 花粉-----多细胞花粉粒----细胞团（愈伤组织）-----继代培养-----单倍体植株。 2、胚状体发生型 花粉-----多细胞花粉粒----进一步培养----胚壮体-----释放-----植物体。 第三节 三、单倍体植株再生、鉴定及加倍 第三节 （二）、单倍体植株鉴定 1、染色体直接计数法：通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。 2、间接鉴定 （1）流式细胞仪鉴定：主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。 （2）细胞形态学鉴定法：叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 第三节 （3）植株形态学鉴定法：单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。 （4）杂交鉴定法：自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。 （5）分子标记鉴定 如RFLP、RAPD、AFLP等 第三节 （三）、染色体加倍 1. 茎段培养：将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。 2. 化学试剂诱变：秋水仙素诱导 （1） 浸泡法：无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株，再转移至新鲜培养基中培养。 （2） 生长锥处理：秋水仙素水溶液直接涂抹生长点（顶芽或腋芽）。 （3） 培养基处理：将单倍体植株和任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度和秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的相同培养基中继续培养诱导胚状体。 第三节 花药和花粉培养基本流程： 预处理花药（物理或生理逆境） 收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子 培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体 胚状体转移至固化培养基上”萌发”形成小植株。 选择合适的供体植株（F1） 倍性鉴定或染色体加倍 第三节 四、花粉培养与花药培养的比较 第三节 花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小孢子启动第一次分裂，小孢子培养则不会 花粉已是单倍体细胞，诱发都是单倍体植株或双单倍体，不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株 花粉培养获得的材料总是纯合的 由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料 可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，是遗传与发育研究良好的材料体系 1. 供体植株的生长条件 烟草：短光周期（8h）和高光强（16000lux） 大麦：低温（12 ℃ ）和高光强（20000lux） 油菜：高光强和一定的温度变化 2. 供体植株的年龄 多数情况下幼年植株优于老年植株 第三节 五、影响花药培养的因素 3. 花粉发育时期 花粉发育时期对诱导雄核发育非常重要 一般从单核早期到双核早期 第三节 发育时期 物种 减数分裂期 草莓、番茄 四分孢子期 葡萄 单核早中期 大麦、天仙子、马铃薯 单核晚期 荔枝、茄子、青椒、小麦 单核早期至晚期 烟草 单核早期至双核期 梨、水稻、甘蓝 花粉发育时期的确定 花药在接种以前，一般需先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系 根据花蕾和花药的长度判断小孢子发育时期，从而为取材提供参考 第三节 单核晚期 第一次有丝分裂后期 双核早期 双核中期 4. 花蕾和花药的预处理：低温、EMS、秋水仙素、γ射线、酒精、高低渗、饥饿处理、高温处理、重金属胁迫等 低温预处理： 烟草 3～5℃ 72小时 水稻 10℃ 10～14天 第三节  5. 供体植株的基因型 供体植株的基因型是影响花药培养和花粉培养的关键因素 不同基因型的植株对培养的反应不同 表现为是否可诱导胚状体的生成，生成胚状体的多少，以及由胚再生成植株的能力大小 第三节  基因型 接种 愈伤 再生率（%） 植株数/花药 花药数 产量 绿苗率 白苗率 绿苗数 白苗数 绿苗/白苗  Igri 180 10.57 33.33 16.67 3.52 1.67 2.0 Igri HO 420 12.92 30.64 3.23 3.96 0.42 9.4 Igri H1 180 22.18 30.30 18.18 6.72 4.03