NGF对表达突型APP的PC12细胞作用机理的实验研究.pdfVIP

中文摘要 目 的： disease，AD)是常见的老年人慢性退行性 阿尔茨海默病(Alzheimer’S 神经疾病，AD的主要病理学标志包括老年斑(SP)和神经原纤维缠 A[340和Ap42)，由淀粉样前体蛋白(amyloidprotein，APP) precursor 分解而来，被认为在AD的发病中起着十分重要的作用。目前许多证 据表明，APP基因的点突变、代谢异常及过表达所引起的AB聚集， 是AD发病的重要原因之一。越来越多的研究证实AD存在多基因缺 了许多AD转基因动物模型。然而，受不同内外环境的影响及不同的 实验条件限制，不便于系统探讨AD特征性标志产物APP及AB的 表达及其对细胞的影响。目前，国外对AD病的致病机制的研究主要 集中在转基因动物模型上，国内尚无通过转基因技术建立转基因AD 细胞模型并使用NGF进行干预的报道。本研究旨在构建突变型APP 基因序列的质粒并转染PCI2细胞，观察APP及AB的表达、细胞形 态及细胞周期的改变，并使用神经生长因子(NGF)进行干预，系统 治疗作用。 方法： 1．质粒构建：NCBI网站上查找APP基因及其启动子的序列， T 分析其区域，设计引物，以人胎脑组织cDNA作模板扩增APP序列， PCR方法扩增突变型APP基因，将突变型APP基 同时采用over—lap 因与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合后构建成真核表达载体 Tmu．APP．GFP，并测序证实。 的表达以及细胞形态及细胞周期的变化：将Tmu—APP．GFP质粒DNA 表达，并在转染24h、48h、72h三个时间点进行AB的放免测定，流 式细胞仪检测细胞周期。 3．NGF对PCI2细胞作用研究：将PCI2细胞按转染和非转染， 加用与不加用NGF培养液以及加用NGF培养液的先后顺序分为 分别进行RT-PCR检测PCI2细胞中APPmRNA表达、AB的放免测 定及流式细胞仪检测细胞周期。 结果： 1．突变型APP基因和GFP基因融合后的真核表达载体经酶切 检测及测序分析证实构建成功。 染的细胞；经放免测定的AB含量在24h、48h、72h三个时间点，转 染组较非转染组均有明显的提高(PO．05)；经流式细胞仪检测，转 染组较非转染组处于Go期的细胞明显增多，而进入S期的细胞减少， 增值指数(PI)明显降低(P0．01)。 期明显增多，而进入S期的减少；但相比APP组，NGF／APP组细胞 组也有显著差异(P0．05)。 结论： 1、突变型AD细胞模型是用于APP异常代谢途径，AD发病分 子和细胞水平机制，药物筛选及药物的作用机制研究的重要工具。 2、APP基因突变是导致神经元细胞形态学、细胞周期、APP表 达异常及AB分泌增加的分子基础。 泌及细胞周期迟滞具有改善作用。 关键词：阿尔茨海默病，突变型淀粉样前体蛋白基因，p一淀粉样蛋白， 神经生长因子 111 ABSTRACT objective： Alzheimer’S the seenchronic disease(AD)iscommonly in main neuropathyelderlypopulation．Thepathological degenerative thesenile the include plaque(SP)andneurofibrillarytangles change inSPis main of sediment