生物化学第十五章基因和蛋白质工程要点.ppt

第十五章 基因工程和蛋白质工程简介 第一节 DNA重组和基因工程 一、DNA重组的 技术路线 二、限制性内切酶（见第十章） 常用的DNA限制性内切酶的专一性 限制性内切酶类型 限制性内切酶的命名和意义 pBR322质粒的结构 以?噬菌体为载体进行DNA克隆 ?噬菌体感染大肠杆菌的途径 DNA重组体的筛选 pBR322质粒结构 原位杂交法筛选DNA重组体图解 DNA重组技术的应用 胰岛素原的人工合成 Ti质粒为载体的植物基因工程 第二节 蛋白质工程简介 生物酶工程示意图 第二节 蛋白质工程简介 一、蛋白质工程的概念 蛋白质工程是研究蛋白质结构与功能的关系，然后人为地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。 或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。 1、基因定点突变 将基因的某个或某些位点进行人工替换或删除 的过程。 2、蛋白质设计 依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立， 按照蛋白质构效关系的理论基础， 设计出比天然蛋白质性能优越的新型蛋白质。 二、蛋白质工程的一般技术 （一）、蛋白质工程的理论设计 活性设计：考虑被研究的蛋白质的功能，涉及选择化 学基团及其空间取向。 专一性设计：指功能性蛋白质在发挥其生理功能时， 总是与其他分子发生专一性相互作用。 框架设计：是指对蛋白质分子的立体设计。 （二）、定点突变技术 通过删除或置换DNA片段中的核苷酸，使基因发生改变，从而产生新的蛋白质。 改变DNA核苷酸序列的几种方法： 1.基因的化学合成 2.基因直接修饰法 3.盒式突变技术 三、蛋白质工程的应用示例 （一）、蛋白质工程酶 (p.493 川大) 1.改变酶的催化活性 2.改变酶的底物专一性 3.提高酶的稳定性 4.改变酶的反应特性 5.产生新酶 （二）、药物研制 1. ?-干扰素 2. 白细胞介素2 3. 胰岛素 尽管蛋白质工程的发展历史很短，但由于它在理论上对生命科学发展的贡献，以及商业上可能带来的巨大价值，使得它的发展异军突起，迅猛异常。总之，由于蛋白质工程能按人的意愿定向地改造蛋白质和酶，必然有着无限广阔的发展前景。 蛋白质技术和核酸技术的相互增强 第三节 核酸研究技术简介 一、DNA测序的基本战略 酶法序列分析的原理 引物标记法测序(Dye Primer) 终止法测序(Dye Terminator) 二．基因文库与cDNA文库 基因文库 cDNA文库 基因文库和cDNA文库的建立 噬菌体为载体的基因文库的构建 三、聚合酶链式反应（PCR） PCR技术原理示意图 PCR技术的发展与应用 DNA芯片技术简介 DVA芯片工作示意图 第四节 基因工程研究进展 见另一个文件！ 插入表达载体 转化寄主细胞 推导出AA顺序 制备合成肽 制备对所编码蛋白专一的抗体 基因或cDNA 蛋白质 蛋白质 测定出AA顺序 合成cDNA探针 制备专一的抗体 沉淀核糖体分离mRNA 用Southern印迹法筛选DNA文库 基因或cDNA 一、DNA序列测定 二、基因文库与cDNA文库 三、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。 ?酶法 ?化学法 ?测序技术进展 酶反应 电泳方向 模板 CCGGTAGCAACT 3′ 5′ GG 5′ 3′ 引物 dATPdCTPdGTPdTTP +ddATP dATPdCTPdGTPdTTP +ddTTP dATPdCTPdGTPdTTP +ddGTP dATPdCTPdGTPdTTP +ddCTP GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCGTTG GGCCATCG