DNA加合物的学发光检测.pdfVIP

苎壁型 ：要型堕塑旦 摘 要 DNA加合物是致癌物或其代谢产物与DNA分子的亲核位 点形成的共价结合物，是一种重要的暴露标志物。DNA加合物 的形成代表着化学致癌过程中的一个早期的、可检测的关键阶 段。(辁测DNA加合物在肿瘤风险评估中具有重要的意义。近十 年来，、DNA加合物已经广泛应用j三分子流行病学、分子毒理学 及环境科学等学科的研究中。厂“ 目前DNA加合物的检测方法主要有：免疫法、荧光法和“P． 后标记法已及各种色谱方法等，其中”P．后标记法由于具有极高 的灵敏度(1个加合物／108。o正常核酸)，从而成为目前测定DNA 加合物的最主要方法。但32P一后标记法及其改进法仍然存在许多 难以克服的缺点，如放射自显影中经常存在人为干扰斑点，操作 步骤繁琐，放射性同位素对人体有害，而且检测费用较高。此外 方法的特异性和重现性也有待进一步提高。 本研究的目的是利用化学发光技术，建立一种简便实用的 DNA加合物检测新方法。其基本原理是利用特异的核酸酶消化 DNA样品，加合物最终以二聚核苷酸(XpN)的形式存在，然 后在T4多聚核苷酸激酶(PNK)的作用下，将ATP分子的y位 磷酸转移标记到XpN的5端，因此样品中加合物的含量与ATP 的消耗量成正比。利用化学发光法准确检测ATP的消耗量，根 据ATP一的消耗量确定加合物含量。 ． f研究内容分两部分： 1．寡核昔酸5羟基端的非放射性磷标记及化学发光检测 T4多聚核苷酸激酶(PNK)是一种重要的核酸工具酶，它能1 够催化ATP分子的Y位磷酸转移标记到DNA或RNA的5羟基端／ 竺曼!竺查竺 ：!竺竺苎兰查二 f ／常用于核酸探针的放射性标记以及寡核苷酸的磷酸化等。这部分 慎验的目的是研究确定T；多聚核苷酸激酶催化的标记反应中寡 核苷酸底物的量与ATP的消耗量之间的定量关系，为进一步用化 学发光法检测DNA加合物打下基础。 在本研究中，我们用人工合成的六聚寡核苷酸(GACTCA)为 底物，加入定量的ATP，在T。多聚核苷酸激酶(PNK)的作用下， 将ATP分子的Y位磷酸转移标记到六聚寡核苷酸的5端，然后用 化学发光法检测ATP的消耗量。研究确定的标记反应的适宜条件 如下：取4．0ul寡核苷酸溶液(含寡核苷酸O～1．0pm01)于发 Tri 1 s—HCI 光管中，加入2．0ui0×激酶缓冲液(700mmol／LpH mmol／L 7．6，100mmol／L DTT)，加入T4多聚核苷酸激 MgCl。，50 2．Ou 2．0u 酶PNK l(4u)，准确加入ATPl(含ATPI．0pm01)。混 匀，37C。温育45分钟。然后加入10倍稀释的混合发光液100 ul，放置3分钟，放入发光仪中，记录10S积分发光强度。结 果显示在本实验条件下，发光强度与寡核苷酸底物的量在0．05～ 1．Opmol范围内呈良好的线性关系，回归方程为 一．化学发光法检测DNA加合物 在这部分实验中，我们用核酸酶Pl和碱性磷酸单酯酶 (CIAP)消化DNA样品，DNA分子中的加合物最终以二聚核 苷酸(XpN)的形式存在。为了提高灵敏度，可用丁醇分离富集 加合物(XpN)。然后在第一部分的研究基础上，加入T4多聚核 苷酸激酶(PNK)和定量的ATP，标记加合物(XpN)的5。羟 基端，然后用化学发光法检测二聚核苷酸(XpN，即加合物)的 量。同时用六聚寡核苷酸(GACTCA)作为加合物标准，绘制校 准曲线，初步建立了一种新的DNA加合物检测方法。并应用本 法分析测定了不同剂量的苯醌(BQ)、环氧苯乙烯(SO)与小 2 !!墅堕竺』丝竺坚 ／牛胸