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博士论文：尘肺病相关基因筛选研究 中文摘要 尘肺病相关基因筛选研究 劳动卫生与环境卫生学专业 博士研究生姚武 指导教师王治明教授 尘肺病是目前我国职业病中发病率最高、死亡危险性较大、对劳动者 危害最严重的一类。据统计目前我国尘肺病例约占职业病患者总人数的近 三分之二。尘肺发病机制十分复杂，迄今为止尚难以圆满解释其发生过程， 对其发生发展起关键作用的分子尚不清楚，也缺乏对其根治或阻止进展的 方法。以往研究表明，尘肺病的发生、发展是复杂的多阶段过程，其中有 众多细胞和分子的参与及相互作用，因而有可能涉及众多基因的表达活 动。相关基因在尘肺病发生、发展过程中具有不同的作用，但在时问和空 问上又可能相互协调构成一个整体，成为决定尘肺病发生、发展的重要影 响因素之一。因此利用现代分子生物学手段进一步细致观察尘肺病发生、 发展的过程，特别是将众多的尘肺病相关基因作为一个“基因群”(gene cluster)进行研究，筛选出在尘肺病多个环节上具有调控作用的关键基凶， 揭示尘肺病发生、发展在基因水平的本质，对于深入研究其分予机制及探 索健康监护措施、早期诊断方法乃至新的治疗手段都具有重要的意义。 此研究以SD大鼠气管灌注石英粉尘制作矽肺模型，首次采用基因芯 片技术对早期矽肺组织和正常肺组织基因表达谱进行比较研究，首次采用 荧光标旧mRNA差异显示技术对早期矽肺组织中与正常肺组织差异表达 的部分基因进行克隆与鉴定，以初步探讨矽肺发病基因水平的分子变化、 筛选与矽肺发生相关的基因，期望为今后深入研究和阐明尘肺病发生、发 I 博士论文：尘肺病相关基因筛选研究 展过程的分子机制及确认尘肺病的关键性调控基因提供基础资料，并为进 一步深入研究尘肺病健康监护措施、早期诊断方法和新的治疗手段提供相 关理论依据。另外，首次通过对中国河南省汉族煤工尘肺患者和煤尘接触 中的可能作用，期望对于阐明基因多念性与煤工尘肺等尘肺病的遗传易感 性关系提供相关线索和参考依据。 一、利用基因芯片技术筛选矽肺相关基因研究 基因芯片是近年来发展起来的一项新技术。其原理是将高密度特定的 寡核苷酸片段或基因片段阵列作为探针，通过高速机器人或原位合成方式 以一定的顺序或排列方式使其附着在玻璃片等固相表面上，然后与待测的 标记样品的基因按碱基配对原理进幸于杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系 统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每～探针上的荧光信号做出比 较和检测，从而迅速得出相关的信息。基因芯片为研究各种疾病发生、发 展过程中的基因表达谱和关键性基因提供了强有力的工具。 司的共有5705条大鼠基因的基因芯片，首次对早期矽肺组织和正常肺组 织基因表达谱进行比较分析研究，筛选出在早期矽肺组织样品与J下常肺组 矽肺发生可能导致组织细胞功能简化，且有大量未知基因需要深入研究。 这些差异表达的基因涉及参与细胞转运、转录调控、信号转导、应激反应、 代谢酶、发育、细胞构建与发生、细胞运动、分化、细胞周期、细胞粘连、 细胞凋亡等重要生命活动的基因及原癌基因。实验结果为尘肺病发生发展 过程中氧化损伤、“钙超载”损害巨噬细胞、细胞因子作用的存在及免疫 2 博士论文：尘肺病相关基因筛选研究 反应的参与等提供了基因水平的证据和相关线索。实验结果还提示，原癌 基因和抑癌基因在尘肺病发生过程中的作用及规律、信号网络系统参与调 控尘肺发生过程中的相关基因表达规律、血管内皮生长因子及热休克蛋白 等在尘肺中的意义均值得进一步探讨。实验结果说明，基因芯片技术在探 讨尘肺病发生、发展的基因水平的分子机制、筛选尘肺病相关基因及进一 步深入研究尘肺病健康监护措施、早期诊断方法和新的治疗手段等方面有 着广阔的应用前景。 二、mRNA差异显示法筛选矽肺相关基因研究 mRNA差异显示(mRNA DD)技术可比较不同类型组织(细胞)或相 酞胺凝胶电泳为基础的技术，也是目前常用筛选差异表达基因的方法之 一。它利用真核细胞mRNA cDNA。然后以原3喘锚定引物和5’端的随机引物所构成的引物列对全部 回收差异条带、再扩增之后可进行克