探讨ARM结构缺失对SPAG6在真核细胞中定位的影响.pdfVIP

A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master in Medicine Effect of ARM Domain Deletion on SPAG6 Subcellular Localization in Eukaryotic Cell Master Candidate： Wang Zhiqiong Major ： Epidemiology and Health Statistics Supervisor ： Prof. Zhang Zhibing Wuhan University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430081, P.R.China May, 2014 万方数据 万方数据 摘 要 目的：构建 SPAG6 基因全长及六个不同长短 ARM 序列的真核表达载体 pEGFP-N2-SPAG6-△ARM ，探讨融合蛋白在细胞内表达及定位。观察全长及六个 ARM 结构缺失后对真核细胞 CHO 细胞中 SPAG6 蛋白定位的影响。 方法：1. 利用 NCBI 数据库，寻找小鼠 SPAG6 蛋白的保守功能区，分析全长蛋白 序列，检索出 SPAG6 有七个 ARM 区域；2. 以健康成年雄性小鼠的睾丸组织为来源， 建立小鼠睾丸 cDNA 文库；3. 以小鼠睾丸 cDNA 文库为模板，PCR 扩增 SPAG6 全长及六个不同长短 ARM 结构的编码序列；4. TA 克隆后测序；5. 构建携带不同 长短 ARM 序列的真核表达载体 pEGFP-N2-SPAG6-△ARM ，对阳性克隆进行酶切 和测序鉴定，将构建的重组质粒转染到 CHO 细胞中；6.分别提取细胞蛋白进行 Western blot 检测，利用共聚焦激光扫描显微镜观察七个不同 SPAG6/GFP 融合蛋白 在 CHO 细胞内的定位。 结果：酶切和测序鉴定表明，全长及六个缺失不同长短ARM 结构的真核表达质粒 构建成功，转染实验发现重组质粒均能够在 CHO 细胞中表达，但仅全长表达产物 定位于微管，缺失任何一个 ARM 区域都可影响在细胞中的微管定位。 结论：SPAG6 在真核细胞内的正确定位依赖于全长。该研究为进一步研究 SPAG6 蛋白的结构与功能奠定基础。 关键词： 男性不育；SPAG6；ARM 结构域；蛋白定位 I 万方数据 Abstract Objective ：To construct the eukaryotic plasmid containing the SPGA6 (full length and different ARM domains sequences), express the protein in the mammalian cell ，and further examine the effect of armadillo (ARM) domains on Sperm- associated antigen 6 (SPGA6) localization in CHO cells. Methods: 1.