核转录因子NR2及亚砷酸钠影响脂肪细胞分化的作用机制研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 核转录因子NRF2及亚砷酸钠影响脂肪细胞 分化的作用机制研究 目 的 脂肪组织在能量储存、物质代谢和内分泌等过程中发挥着重要的生物学作用。 脂肪细胞分化异常(肥胖与分化不良)与胰岛素抵抗发生密切相关。肥胖是一种 慢性代谢性综合症，肥胖者机体常处于慢性氧化应激和炎症状态。活性氧在脂肪 细胞分化过程中的作用已开始引起科学界的关注，但确切机制目lj{『仍不清楚。核 转录因子NF．E2相关因子2(NRF2)属于CNC碱性亮氨酸拉链蛋白家族成员， 是启动细胞抗氧化反应的主要调控因子。本实验室前期研究发现，NRF2基因敲除 小鼠体重明显低于野生型，抵抗高脂饮食诱发的肥胖，脂肪组织中PPAR丫蛋白水 平明显降低。同时发现，小鼠3T3．L1细胞和人皮下前脂肪细胞NRF2基因沉默后， 分化能力明显减弱，PPART蛋白水平明显低于对照组。基于前期的研究结果，本 研究中我们进一步探索NRF2调控删脚表达的机制，加深对氧化应激与脂肪细 胞分化之间关系的认识。 砷是国际肿瘤研究机构(IARC)确认的人类致癌物。长期砷暴露可引发多脏 器损伤，甚至导致皮肤、肺和膀胱等部位的癌症。大量流行病学调查资料显示， 砷暴露与2型糖尿病发病密切相关。目前已有文献报道，砷能够降低脂肪细胞 PPAR7蛋白水平，阻碍PPA脚与其受体之间的相互作用，最终抑制脂肪细胞分化。 尽管如此，砷抑制脂肪细胞分化的确切机制仍不清楚。本研究从砷降低脂肪细胞 PPA脚蛋白水平的现象入手，从氧化应激和内质网(ER)应激两个方面，探索砷 在脂肪细胞分化早期抑制PPAR7表达的机制。 方法 1、细胞培养与分化 应用含10％dx牛血清、50units／ml青霉素和50 llg／ml链霉素的高糖DMEM培养 基，于37 oC和5％C02条件下培养小鼠3T3．L1前脂肪细胞。每隔2或3天更换培养基。 待细胞汇合达N80％．90％时，．应用胰酶／EDTA处理，传代继续培养。 向含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(50units／m1)和链霉素(50 gg／m1)的高 (Insulin)三种物质，配制成“DMI”分化培养基，为提高分化培养基诱导能力， 简称为“DMI—RI分化培养基。 2、建立NRF2幂NKEAPl基因沉默的前脂肪细胞模型 系。选择于3．5天内能够将全部正常前脂肪细胞杀死的嘌呤霉素浓度配制选择培养 转导至小鼠3T3．L1前脂肪细胞系。步骤为：将正常3T3．L1细胞接种于6；fL板内，待 细胞汇合至40％．50％时，向细胞中分别添加海美溴铵(HB)和病毒颗粒。次日将 KEAPl基因稳定沉默的细胞模型。 3、细胞活力测定(MTS) 应用MTS方法检测亚砷酸钠(NaAs02)的急性细胞毒性。步骤如下：将细胞 按lxl04个／孔接种于96孔板内，置于细胞培养箱24d时后，弃掉培养基，应用含有 不同浓度砷的培养基继续培养24d时或48d时，之后应用非放射性细胞增殖检测 试剂盒检测细胞活力。结果用砷暴露组细胞活力占对照组细胞活力的百分比表示， 并制作细胞活性线性图形。 4、油红染色(Oil—redO Stainning) 2 二醛中固定5分钟，在摇床上用PBS连续冲沈3次，每次5分钟。弃去PBS后，使用 60％的异丙醇冲洗一次，加入油红染料，摇床上震荡30分钟之后60％异丙醇再冲洗 一次，PBS冲洗一次，加入PBS留待显微镜观察、照相或扫描。 5、Western Blot免疫印迹 简要步骤如下：收集处理后的细胞，提取总蛋白或核蛋白。使用BCA或Bio．Rad 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。经过蛋白稀释，变性，电泳，转膜，一抗孵育， 洗膜，二抗孵育，洗膜，显色和扫描后分析蛋白表达情况。 6、mRNA提取与实时定量PCR(RT．PCR)分析 引物应用Primer