棉籽蛋白发酵制ACE抑制肽.pdf

摘要 棉籽蛋白是一种重要的植物蛋白质资源，其氨基酸种类齐全，比例适当， 价格低廉，是一种高质量的食物和饲料用蛋白。棉籽榨油得到的棉籽粕含有 丰富的棉籽蛋白，但由于棉酚的存在，严重影响了棉籽蛋白的开发利用，仅 有少量棉籽蛋自用于饲料添加。随着脱毒技术的发展和无毒棉的培育成功， 给棉籽蛋白的应用开发提供了很好的发展前景。利用脱毒的棉籽蛋白制备有 生理功能的活性多肽，用于保健食品和药品，不但对增进人类健康有着重要 作用，也对延长棉花加工的产业链有着重要的意义。目前使用微生物发酵法 制备棉籽蛋白ACE抑制肽的深入研究尚未见到详细报道。本论文以脱酚棉 籽蛋白为原料，分离筛选高效安全的生产菌株，发酵制备ACE抑制肽，通 过对发酵条件的优化，提高棉籽发酵液中ACE抑制肽的含量，最后使用超 滤、凝胶层析和反相高效液相色谱对发酵液中的ACE抑制肽进行分离纯化， 并鉴定ACE抑制肽的氨基酸序列，为棉籽蛋白的开发提供理论依据和技术 支持。主要结果如下： 1．从分离到的乳酸菌和芽孢杆菌中筛选出产蛋白酶的菌株，根据菌株 对棉籽蛋白的水解能力以及发酵液的ACE抑制率，选择最适的发酵菌株。 结果表明，从选用的泡菜汁中获得了4株乳酸菌，分别标记为Ll—【4。通过 观察这4株乳酸菌和枯草芽孢杆菌NCT314酪蛋白水解圈的有无可以发现， 除了乳酸菌L3之外，其余4株菌都可以产生蛋白酶。将产蛋白酶的菌株接 种到棉籽蛋白发酵培养基中进行发酵，检测结果表明，枯草芽孢杆菌NCT314 发酵棉籽蛋白发酵液的水解度和ACE抑制率为最高，分别为18．36％和64．86 ％。因此选择枯草芽孢杆菌NCT314作为棉籽蛋白ACE抑制肽的发酵菌株。 2．以脱酚棉籽蛋白为原料，以枯草芽孢杆菌NCT314为发酵菌，对其 发酵条件进行了优化。首先以水解度和ACE抑制率为指标，进行了不同发 酵时间(0、6、12、20、22、24、26、30、36、48、60h)、不同发酵温度(27、 不同接种量(1％、3％、5％、7％、9％)的单因素试验，结果表明，当发 酵时间为24 h，发酵温度为32℃，pH为7．O，接种量为5％时，棉籽蛋白 发酵液ACE抑制肽的产量可达到最好。在单因素试验结果的基础上，以发 酵液ACE抑制率为响应值，选取发酵温度、发酵时间和pH这三个影响显著 的因素，设计响应面试验。通过响应面试验对以上发酵条件的优化，得到最 佳发酵条件为：温度32．08℃、时间22．6 h、pH为7．2，若在此发酵条件下， 摘要 发酵液的ACE抑制率最高可达78．06％。 3．对发酵液中的ACE抑制肽进行了分离纯化。将棉籽蛋白发酵液中的 (I冲．m，LC)分离纯化。结果表明，棉籽蛋白发酵液经超滤分离后可分为4 kDa)和U4 kDa)、132(30~10kDa)、u3(1肛5 个组分，分别是Ul(30 (5 kDa)。其中，U4组分具有较强的ACE抑制能力，其ICso为0．94mg／mL。 G．25分离后可得到3个洗脱峰，分别标记为Sl、S2和 U4组分经Sephadex S3。通过测定各洗脱峰的ACE抑制活性可知，组分S2的ACE抑制能力最强， IC50可达0．19mg／mL。使用制备型RP．HPLC可进一步将S2分成5个峰组分， 分别编号为1～5号，收集各峰组分，经测定，4号峰组分具有较强的ACE 号峰组分只含有一个肽段。最后，4号峰是一个由五个氨基酸连接成的肽段， 关键词：棉籽蛋白；发酵；ACE抑制肽；分离纯化 Ⅱ Absract ABSRACT Cottonseedisan and resourcesdue high protein proteinimportant qualityplant t0its amino an