核转录因子Nr-1在脂肪细胞侵华及砷致胰岛素抵抗中的作用.pdf

·中文论著摘要· 核转录因子Nrfl在脂肪细胞分化及 砷致胰岛素抵抗中的作用 目 的 脂肪细胞在能量储存和代谢中发挥着重要的作用，由其所分泌的不同因子具有 影响食欲、胰岛素敏感性、炎症反应以及其他生物学通路的作用，具有重要临床意 义。肥胖，是慢性代谢综合症的主要病因之一，机体通常处于慢性氧化应激和炎症 状态。然而，活性氧在肥胖的发生发展中的作用却一直不清。核转录因子NF．E2相 关因子(Nrfs)是启动抗氧化反应元件的转录因子，属于ChIC家族的碱性亮氨酸拉 链蛋白。在本研究组最新的研究中已证实，Nrf2可以通过调控PPAR7的表达而影响 脂肪细胞的形成过程，鉴于Nrfl在结构以及在调控抗氧化酶基因等功能上与Nrf2 的相似，以及在不同器官中的独特作用，我们认为其在调控脂肪细胞分化过程中极 毒，感染小鼠3T3．L1前脂肪细胞系，建立小鼠Nrfl基因沉默的前脂肪细胞系，并 迸一步研究该基因在脂肪细胞分化和脂肪代谢过程中的作用。 砷及其化合物是国际癌症研究机构(IARC)确认的人类致癌物。长期饮用高砷 水除可导致砷性皮肤损伤及皮肤癌、内脏肿瘤、心血管疾病外，近年来的流行病学 发现，砷中毒还可以导致糖尿病的高发。那么，低浓度砷长期暴露是否可以导致成 熟脂肪细胞胰岛素敏感性下降，即胰岛素抵抗，目前，还没有相关机制研究。因 此，在本研究中，我们试图探讨低浓度的砷是否可以通过对Nrfl或Nrf2的调控而 激活抗氧化酶，进而抑制胰岛素刺激脂肪细胞糖摄取所依赖的ROS信号传导通路， 而导致胰岛素抵抗。 方法 1、研究对象 1)细胞培养 50 units／ml青霉素和50 p咖l链霉素的高糖DMEM培养基，于37。C、5％C02， 95％大气条件下培养。 2)细胞分化 的诱导剂简称为“DMI”。此外，为加快细胞的分化速度，还可以向DMI中补充添 培养基称为“分化培养基”。 2、建立Nrn沉默的3T3L1细胞系 的颗粒转导至小鼠3T3L1前脂肪细胞系。转导前24d时，细胞以40．50％的融合率被 接种于6孔板。次日，以每孔8 105 Units，传导单位)的 pg／ml和2x TU(Transducing 浓度向细胞中分别添加海美溴铵(Hexadimethrinebromide)和病毒颗粒。隔夜孵育 后，将含有病毒颗粒的培养基换为含有2 基，对细胞进行筛选，建立Nrfl基因沉默和Scr稳定传染的细胞模型。待细胞达到 90％融合后，用含有puromycinl整／培养基将其传代。其中，在进行传导实验之前，先 确定于3—5天内可将全部细胞杀死的puromycin的浓度。 3、油红染色(Oil—red Stainning) 2 油红染色步骤如下：将细胞培养基弃去，冷PBS冲洗细胞3次，于10％中性缓冲 福尔马林(10％neutral．bufferedformalin)中固定5分钟，冷PBS再次冲洗细胞3次， 并于摇床上连续冲洗5分钟，其间换液2次。弃去PBS后于油红染料中染色30分钟， 而后用PBS再次冲洗细胞，上扫描仪扫描。 4、蛋白提取、定量与WesternBlot 免疫印迹法(Westernblot)检测上述基因的蛋白表达情况：收集细胞、裂解细 胞后，提取总蛋白。核蛋白提取按照试剂盒说明书进行，提取后置于一80℃保存。 调整总蛋白或核蛋白浓度一致，进行蛋白电泳。蛋白电泳后，将蛋白转印到PVDF膜 上，封闭后分别加入适当比例稀释的一抗杂交，然后加入各自相应的二抗再次杂 交。 5、mRNA提取与定量Real．timePCR分析 time PCR操作方 应用TRIzol(invitrogen)法进行细胞