线粒体损伤在α子致细胞恶性转化中的作用.pdfVIP

线粒体损伤在α粒子致细胞恶性转化中的作用 中文摘要 中文摘要 目 的：探讨并验证线粒体功能改变和线粒体DNA 突变在α粒子致细胞恶性 转化中的作用机制。 方 法： (1) 建立α粒子体外照射致人小气道上皮细胞 (Small airway epithelial cells, SAEC) 恶性转化的模型。不同剂量(0.2、0.4、0.8、1.0、2.0Gy) α粒子分单次 和多次照射SAEC 细胞，平板克隆形成试验检测不同剂量α粒子对SAEC 细胞的 存活分数影响。细胞照射后常规培养于37℃，5% CO2 培养箱中，定期检测细胞对 血清和 PALA 的抵抗性以及细胞的增殖活性。同时检测细胞在软琼脂中的锚着独 立生长能力，Transwell 小室观察细胞的侵袭特性，Western blot 法测定癌基因c-myc 和抑癌基因 p53 的蛋白表达。选择具有恶性转化特性的细胞接种裸鼠，观察裸鼠 体内的成瘤情况。(2) 检测恶性转化细胞中线粒体功能与线粒体DNA 的突变情况。 以12S rRNA 扩增线粒体DNA ，18S rRNA(GAPDH)扩增核DNA ，Real-time PCR 检测细胞的线粒体DNA 相对拷贝数。采用巢式PCR 联合Real-time PCR 检测细胞 线粒体的Common deletion 缺失率。生化试剂盒和Western blot 检测细胞线粒体细 胞色素C 氧化酶(Cytochrome C Oxidase, COX)活性和蛋白的表达。JC-1 荧光探针 流式细胞仪检测细胞的线粒体膜电位。氧电极法检测细胞的氧耗量情况。以软琼 脂克隆形成率、c-myc 为自变量，SPSS17.0 软件分析线粒体拷贝数、common deletion 缺失率、COX 活性、膜电位、氧耗量与细胞恶性转化程度的相关性。(3) 通过大 鼠吸入试验验证细胞的体外染毒结果。Wistar 大鼠置于多功能生态氡室慢性吸入染 毒，累积染毒剂量分别达100、200 、400 工作水平月(Working level month, WLM)， 组织病理学HE 染色和masson 胶原纤维染色观察氡致大鼠肺组织的病理学改变。 分离大鼠肺组织线粒体，生化试剂盒测定线粒体COX 活性，并与病理学改变作相 关分析。 结 果：(1)细胞存活分数显示随α粒子照射剂量增大细胞存活分数逐渐降低， 呈剂量－效应关系。照射后培养过程中，细胞逐渐出现转化特性，血清抗性和PALA 抗性以及细胞增殖活性显著增加，出现生长接触抑制。首次照射后 4 个月，照射 组细胞具备明显的锚着独立生长能力，可形成软琼脂克隆，其中 0.8Gy 组克隆形 I 中文摘要 线粒体损伤在α粒子致细胞恶性转化中的作用 成率最高，形成的克隆也最大。侵袭试验显示照射组细胞侵袭能力明显增强，同 时癌基因c-myc 蛋白表达明显升高，而野生型抑癌蛋白p53 减少或消失，表明照 射组细胞已发生恶性转化。裸鼠接种试验，细胞接种后4 个月，0.8Gy 多次照射组 5 只裸鼠有3 只在接种部位出现结节，组织病理鉴定为上皮源性肿瘤。(2)Real-time PCR 结果显示各转化组细胞线粒体拷贝数增加1.4-2.9 倍，common deletion 缺失率 升高2.6-4.9 倍。线粒体功能检测显示COX 的整体活性下降，COX1 和COX4 的蛋 白表达均降低，线粒体膜电位下降，细胞氧耗量降低。相关性分析显示线粒体拷 贝数、common deletion 缺失率、COX 活性与软琼脂克隆形成率和c-myc 表达之间 呈有统计学意义的相关。(3)大鼠肺组织病理结果，与正常对照组相比，可见氡染 毒组肺间质充血水肿，肺泡间隔增厚，炎症细胞浸润，包括中性粒细胞，淋巴细 胞与巨噬细胞等，肺组织逐渐发生纤维化，肺泡腔逐渐萎缩变小。软件分析结果 显示肺泡间隔厚度逐渐增加，平均肺泡腔面积逐渐减少，COX 活性测定结果显示 其活性随着氡染毒剂量的增加逐渐降低。相关性分析显示肺泡隔厚度与COX 活性 呈负相关，而肺泡腔面积与COX 活性呈正相关。 结 论：(1)α粒子体外