苯并[a]芘暴的小鼠原代支气管上皮细胞中miR-320和miR-494对细胞周期的影响.pdfVIP

苯并[a]芘暴露的小鼠原代支气管上皮细胞中 mi R-320和IiliR-494对细胞周期的影响 硕士研究生：段慧菡 导 师：蒋义国教授 广州医学院化学致癌研究所 中文摘要 背景与目的 寡核苷酸(nucleotide，nt)左右，其与靶基因mRNA3’UTR上靶序列碱基配对，在 转录后水平抑制蛋白质翻译或降解mRNA，是发挥功能的基础。miRNA对基因表达 的调控现象在真核生物中广泛存在，不同的组织器官、不同类型的肿瘤、肿瘤的不 同发展阶段都存在不同的miRNA的表达，使miRNA表达谱具有组织细胞特异性。苯 并【a】芘(B【a】P)是常见的环境污染物，在生产和生活中有许多的暴露机会，也是吸 烟相关肺癌的发展中起关键作用的成因之一。肿瘤是一类细胞周期性疾病，致癌作 用被看作是细胞周期内在机制紊乱的结果。细胞周期存在多个检查点(checkpoint)调 节各期间的转换及细胞周期进程。在课题组前期工作中，已发现miR．320和 miR．494在B[a]P染毒细胞的细胞周期中的作用。 方法 1．小鼠原代支气管上皮细胞的培养在无菌条件下处死小鼠，取出支气管， 子12次，重复操作一次。离心，用Culture培养基重悬细胞。将此细胞悬液接种于 60mm的培养皿中，2h后收集未贴壁细胞。将细胞接种于已用胎盘胶原包被的24 孔板内，用Culture培养基在正常培养条件下，37oC、5％C02下培养24h。次日 弃去Culture培养基，添加Differentiation培养基，37oC、5％C02下培养。 度不超过O．1％。用经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆微粒体酶系(Co—factor supplemented post—mitochondrial 外代谢活化系统。S9混合液随配随用。原代细胞在无血清培养的第二天，分别用 用12h、24h、48h后弃去染毒液，PBS洗涤，继续在正常培养条件下无血清培养。 3．原代细胞的转染转染实验步骤按照Hiperfect转染试剂24孔板转染操作指 测抑制物的转染效率可达90％-,95％。 4．QRT-PCR检测miR-320和miR-494的表达用Trizol抽提各组样本的总 miR．320、miR-494及18sRNA的定量PCR反应体 RNA。按下列成分分别组成20I_tl 2xReai-timePCRMaster miRNA 系：10I-tl Mix，O．1 61．tl specificprimerset(20pM)，2山 eDNA 0．2I_tl template，andTaq 法对基因表达进行分析。 5．流式细胞仪检测细胞周期的分布 将细胞悬液离心，加入缓冲液重悬细胞， TESTPlusDNA 参照Cycle LT 分析细胞DNA含量，并应用Modfit3．0软件分析细胞周期。 6．流式细胞仪检测CDK6的表达水平采用间接免疫荧光标记法进行免疫荧光 指数(fluorescenceindex，FI)表示CDK6的相对含量。 7．统计学方法实验数据均以均数4-标准差表示，采用SPSS15．0统计软件处 理，采用独立样本t检验进行数据分析，尸0．05为差异有统计学意义。 结果 1．00pM B[a]P作用24h的条件进行后续的实验。 2．mi R-320和mi 却无明显的变化，差异无统计学意义(尸O．05)；同样地，miR．494的表达水平在 明显，差异无统计学意义(尸0．05)。 胞经过1．001_lMB[a]P作用24h后，出现了Gl期阻滞的现象。与溶剂对照组的62．70％ 细胞停留在此间期，差异具有统计学意义(尸0．05)。在分别转染了miR．320和 0．05)。而在anti．miR．nc组里，Gl期细胞比例无明显的改变。