产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)钼铁蛋白alpha;-423Ile位点的突变导致固氮酶催化活性降低.pdfVIP

2014 年 第 59 卷 第 13 期： 1215 ~ 1222 《中国科学》杂志社 论 文 SCIENCE CHINA PRESS 产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)钼铁蛋白α-423Ile 位点 的突变导致固氮酶催化活性降低 郭青娟, 彭涛, 常天驹, 张刚, 姜伟, 李颖, 李季伦* 农业生物技术国家重点实验室, 中国农业大学生物学院, 北京 100193 * 联系人, E-mail: lijilun@ 2013-07-07 收稿, 2013-08-26 接受, 2014-03-26 网络版发表 国家重点基础研究发展计划(2010CB126504)、农业生物技术国家重点实验室项目和中国农业大学研究生科研创新专项(KYCX2011023)资助 摘要 基于前期对固氮酶催化过程中存在两条电子传递通路的推论, 探索从与 P 原子簇 关键词 共价相连的β-93Cys 出发至FeMoco 之间重要的氨基酸位点. 通过分析固氮酶钼铁蛋白的结 产酸克雷伯氏杆菌 构, 利用体外定点突变和基因替代技术, 将产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca) 固氮酶 固氮酶 Asn Lys Ile Ala His Pro 催化机制 β-102 , α-431 和α-423 位点分别替换为 β-102 , α-431 和α-423 , 获得Nβ102A, 定点突变 Kα431H 和Iα423P 突变株. 3 个突变对细菌固氮生长有不同程度的影响, 其中Iα423P 突变 质子/ 电子传递途径 株几乎无固氮生长, 细胞乙炔还原活性显著下降; 在42 L 发酵罐中培养, 其细胞最高固氮 酶活性仅为野生型菌株的1/6; qRT-PCR 检测发现此突变株nifD 基因4 倍的上调表达. 分 离纯化Iα423P 钼铁蛋白, 其最高C + 2H2 和H 还原水平分别为野生型的13%和21%. 根据以 上研究结果推论, 突变固氮酶的催化活性显著降低, 或与直接打破 α-423Ile 与高柠檬酸长 臂之间的氢键有关, 推测 α-423Ile 是固氮酶催化底物还原过程中, 电子经高柠檬酸长臂进 入活性中心Mo 位的入口氨基酸. 探讨固氮酶催化底物还原的分子机制是一个重 是固氮酶的活性中心; P 簇(P-cluster, [8Fe7S]), 是电 [12] 要的科学议题, 目前发现的原核微生物固氮酶有4 种, 子从铁蛋白向FeMoco 传递的中间递体 . 其中钼铁固氮酶、钒铁固氮酶和铁铁固氮酶三者的差 FeMoco 周围的多肽环境不仅提供其固定的骨架, 异在于活性中心原子簇分别含有钼、钒或仅含有铁; 更是固氮酶还原底物所必需的[13]. 在 Azotobacter 第 4 种是从嗜热自养链霉菌(Streptomyces thermoau- vinelandii 固氮酶中, α-442His 和 α-275Cys (分别对应 totrophicus) 中分离到的依赖于超氧化物歧化