大熊猫Ⅰ类MHC基因的分离及分型技术的建立.pdfVIP

2013 年 第 58 卷 第 16 期： 1520 ~ 1527 《中国科学》杂志社 专辑: 野生动物适应性进化和保护生态学 论 文 SCIENCE CHINA PRESS 大熊猫Ⅰ类MHC 基因的分离及分型技术的建立 朱英, 孙丹丹, 葛云法, 喻斌, 陈艺燕, 万秋红* 浙江大学生命科学学院, 濒危动植物保护生物学教育部重点实验室, 国家濒危野生动植物种质基因保护中心, 杭州 310058 * 联系人, E-mail: qiuhongwan@ 2012-05-06 收稿, 2012-10-08 接受, 2013-05-07 网络版发表 国家重点基础研究发展计划(2007CB411600)、国家林业局大熊猫专项基金(WH0627)和中央高校基础研究基金资助 摘要 濒危野生动物人工圈养繁育是防止或减缓物种走向灭绝的重要保护措施之一, 已在诸 关键词 多濒危动物的重引入工程及野生种群的复壮工程中, 发挥了极为关键的作用. 由于功能基因 大熊猫 的多态性信息是制定圈养种群繁育计划的至关重要的遗传参数, 因此, 在脊椎动物基因组中 Ⅰ类MHC 基因 一类具有高度多态性和在机体的免疫应答与环境适应中发挥关键作用的功能基因家族——主 位点分离 位点特异性基因 要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC), 便成为检测和评估濒危野生动 分型方法 物人工圈养种群免疫应答与环境适应能力的理想分子标记, 并藉此制定科学的繁育计划. 大 熊猫是世界濒危野生动物保护的旗舰物种, 而人工圈养种群的管理信息中尚缺乏 MHC 这一 遗传参数. 鉴此, 本文通过构建大熊猫Ⅰ类MHC 基因的克隆重叠群, 共分离得到了6 个Ⅰ类 MHC 功能基因, 并将其分别命名为Aime -C, Aime -F, Aime -I, Aime -K, Aime-L 和Aime -1906. 组 织表达检测和cDNA 的全序列分析表明, Aime -C, Aime -F, Aime -I 和Aime -L 均具有广泛的组织 表达和正常的外显子结构, 为经典的Ⅰ类MHC 基因; Aime -K 和Aime -1906 为特异性组织表达, 且exon 7 的结构异常, 为非经典的Ⅰ类MHC 基因. 本文进一步通过位点特异的单链构象多态 性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)和测序分析, 建立了大熊猫4 个经典的Ⅰ类 MHC 基因exon 2 和exon 3 的特异性基因型分型方法. 运用该方法对成都大熊猫繁育研究基 地的大熊猫圈养种群进行遗传变异检测, 发现 Aime -F 是单态位点, 而 Aime -C, Aime-I 和 A ime-L 则呈现不同程度的多态性(3 个基因的exon 2 均有4 条等位基因, exon 3 分别有6 条、5 条和 5 条等位基因). 此结果经由已知大熊猫圈养家系的分型验证, 表明其准确有效, 从而为 同领域获取大熊猫Ⅰ类MHC 基因的相关信息, 提供了可靠的技术方法. 近期人类活动造成栖息环境的破坏, 已使地球 标记如微卫星DNA 、线粒体DNA 和单核苷酸多态性 上的许多生物受到了前所未有的生存威胁而沦为了 的遗传多样性分析等, 是主要的检测工具[5,6]. 然而, 濒危物种. 为防止这些濒危物种走向灭绝, 科研人员 这些标记虽然在一定程度上能够揭示物种的遗传多 与管理者在不同的层面上协同制定了若干积极有效