克隆基因的表达与产物纯化外源基因在原核细胞中的表达.pptVIP

六、影响外源基因表达效率的因素 1. 启动子的结构对表达效率的影响 (1)一致顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 (3) -35区和-10区的碱基顺序 (2) -35区与-10区之间的距离 间隔为17bp时，启动子最强。 2. 转译起始序列对表达效率的影响 (1) S-D序列 5’-AGGAGGU-3’ S-D序列后面的4个碱基： 如果是A（T）, 翻译效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25%。 (2) 起始密码AUG AUG左侧的三个碱基也有影响。 β-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 (3) 其它 多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。 噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U。 3. 启动子与外源基因之间的距离 4.转录终止区对表达效率的影响 5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因， 不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。 增加表达效率。 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。 七、提高表达水平常用的方法 1. 选择强启动子序列，如 tac 等 2. 调整S-D序列与AUG碱基的距离 3.改变起始密码下面的几组密码子 一般为5-9bp。 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。 能提高翻译的起始效率。 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性 在外源基因的下游插入“重复性基因外回文 序列”能防止mRNA受到3’→5’外切酶的攻击。 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。 （1）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开。 一般采用温度诱导或药物诱导。 λPL启动子是温度诱导型 32℃ cI857 (cI的温度敏感突变等位基因)阻遏物有 活性，抑制λPL启动子，外源基因不表达， 宿主大量生长。 42℃: cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。 cI857 PL PO 外源基因 λPL启动子是药物诱导型 调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。 无IPTG: 阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。 宿主大量生长。 有IPTG: 阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放， 外源基因大量转录。宿主生长受抑制。 （2）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。 当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。 当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制， 增加拷贝数。 6. 提高表达产物的稳定性 防止被宿主的酶降解。 （1）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。 N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。 （2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。 使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。 细菌蛋白分泌的条件： ① 有信号肽。 位于N端，一般为15-30aa 。真核与原核的结构相似, 功能相似，可以互换。 ② 蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。 为蛋白指明目的地。 ③ 细胞内的转运机制。 信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质 的参与。 真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好 地分泌表达； 但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。 内涵肽 （3）色氨酸启动子trp 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。 （4）PL和PR启动子 四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 1.细胞质中表达 包涵体（inclusion body） 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。 形成原理未知。 ① 优点 ② 缺点 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 回收的蛋白生物活性差。 例： 在大肠杆菌细胞内表达人生长激素 （human growth hormone, hGH）。 2.周质中表达 （1）周质（periplasm） 格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理 目前不完全清楚 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。 ①常用的原核信号肽 （2）信号肽（signal peptide） 能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。 一般