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第二章 基因工程的酶学基础 第一节 限制性核酸内切酶 1. 来源 E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。 二、限制性内切酶的类型 三、限制性内切酶的命名 四. Ⅱ类限制性内切酶的基本特性 （2）切割位点 第二节 DNA 连接酶 二、DNA ligase的特点 2. DNA连接酶催化的连接反应特点 是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。 OH P × × 是相邻的－因此只能封闭nick.不能封闭gap 四、影响连接反应的因素 3 连接酶的浓度： 平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片段之间的连接，0.1个单位。 时间： 16 ℃ 4小时 4 ℃ 过夜 注意事项： 10xLigationBuffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。 T4DNALigase对热敏感，容易失活。使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中冷冻保存。 第三节 DNA聚合酶和反转录酶 二、常用的DNA聚合酶的特点 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 2. Klenow fragment （2）主要用途 ③ cDNA第二链的合成 3. T4 DNA聚合酶 ③ 特点 （2） T4 DNA聚合酶的用途 4. T7 DNA聚合酶 （2）T7 DNA聚合酶的特点 （3）T7 DNA聚合酶的用途 5. 修饰后的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 （3）逆转录酶的用途 三、 DNA连接酶的反应条件 Tris-HCl 50 - 100 mM，pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1 mM DTT 5 mM Volume 10 - 20 ml T T 4 - 15 ℃ ， 4 - 16 hr 1. 反应温度 理论37 ℃ 黏性末端：12～16℃ 平头末端：10～20℃ 2. ATP浓度 一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L. ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接 ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。 增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。 4. DNA末端的浓度 3:1 插入片段与载体的浓度比例 两种构型：线状分子和环状分子 与DNA浓度及DNA分子长度相关 DNA聚合酶（DNA polymerase) 能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’－OH末端，催化核苷酸的聚合作用. 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 7.Taq DNA聚合酶 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’－OH端 2. 主要区别 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 有的DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 持续合成能力和外切酶活性不同。 高 快 有 无 Taq DNA聚合酶 中 低 无 无 逆转录酶 高 快 无 无 遗传修饰T7DNA聚合酶 高 快 无 低 化学修饰T7 DNA聚合酶 高 快 无 高 T7 DNA聚合酶 低 中 无 高 T4 DNA聚合酶 低 中 无 低 Klenow fragment 低 中 有 低 大肠杆菌DNA聚合酶 持续能力 聚合速率 5’?3’外切酶活性 3’?5’外 切酶活性 DNA聚合酶 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 Ⅰ 主要用来制备带放射性标记的DNA探针（32P标记）。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质 ①一条单链多肽 ②5’?3’外切酶活性位于N端 ③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’?3’外切酶活性部分,就成为Klenow fragment。 具有5’?3’聚合酶活性和3’?5’外切酶活性。（失去了5’?3’外切酶活性）。 （1）Klenow fragme