植物核糖体失活白的提取纯化及其诱导白血病细胞凋亡机制的研究.pdfVIP

核糖体失活蛋白的提取纯化及其诱导白血病 细胞凋亡机制的研究 摘 要 inactivatingprotein，RIPs)是一组来源于 ．7植物核糖体失活蛋t!t(ribosomal rRNA第 植物的糖苷酶，其RNAN．糖苷酶活性能使真核细胞核糖体28S 4323位腺嘌呤糖苷键水解、断裂，从而无法与延长因子2结合并导致60S 亚基失活，进而使蛋白质的合成受到不可逆的抑制。根据其亚单位组成的 不同可以将其分为I型和II型核糖体失活蛋白，近年来，陆续有研究指出， I型RIP具有抗肿瘤活性，其抗肿瘤功能在很大程度上依赖于其介导的细 胞凋亡的发生。来自于不同学者的研究指出，用某些I型RIP体外处理肿 瘤细胞后可以观察到多聚核小体的形成、DNA片段化等特征性改变，证实 I型RIP确实可以诱导肿瘤细胞发生凋亡。但是其诱导细胞凋亡的具体分 子机制仍不十分清楚，限制了人们对其抗肿瘤功能的进一步认识。 鉴于RIPs广泛地存在于多种植物中，大量的研究都试图尝试从植物的 不同部位提取出高纯度的RIPs，目前应用得较为广泛的方法是通过盐析法 先粗提出含有目的蛋白的粗蛋白，然后利用大部分RIPs都是碱性蛋白这一 特点，用弱阳离子交换层析将粗蛋白提取物中的碱性蛋白洗脱，再根据洗 脱蛋自分子量的不同利用凝胶层析进一步纯化，最后还要脱盐后才能得到 目的蛋白。利用这种方法纯化RIPs时，一方面步骤较为烦琐，成本也比较 高昂，另一方面，由于弱阳离子交换层析不能针对目的蛋白的特异性基团 进行纯化，因而纯化效果受到了一定的限制，并且利用这种方法最后的产 率并不高，使得这一方法很难得到推广应用。 针对上述问题，结合国内外研究进展／本研究用苦瓜种子作为I型RIP 的供体，根据I型RZP含有核苷酸结合域这一特点，利用可以与这类蛋白 发生特异性结合的三榛类染料CibacronblueF3GA制成的Blue Sepharose V CL。6B亲和层析柱进行假配基亲和层析，再用凝胶层析法进一步 Sepharose 纯化，通过结合使用以上两种不同的纯化方法提取、纯化苦瓜RIP。用纯 化得到的苦瓜RIP处理体外培养的HL．60白血病细胞株，进而运用流式细 胞仪检测、原位凋亡检测等方法观察苦瓜RIP能否诱导HL一60细胞发生凋 亡。同时，利用RT—PCR、Westernblot等方法深入研究了与凋亡密切相关 瓜RIP诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。 厂结果显示： 1．运用硫酸铵分级沉淀、Blue CL．6B假配基亲和层析、 Sepharose Sephadex．G75凝胶层析等方法提取、纯化得到了高纯度的苦瓜RIP，并且 本方法提取效率较高，所获得的RIP在SDS。PAGE上呈现为单一条带。 2．用40pg／ml作用浓度的苦瓜RIP处理HL．60白血病细胞株后，流 式细胞仪检测结果显示处理组细胞有明显的亚GI峰出现，原位凋亡检测结 果也证实了在此作用浓度下苦瓜RIP可以诱导王妇：铷细胞发生凋亡。 3．RT．PCR结果显示，与对照组细胞相比，处理组细胞caspase．3、Bax 的mRNA表达明显升高，而Bcl．2 blot mRNA表达变化并不明显。Westem 蛋白的表达明显升高，而Bcl．2蛋白表达则有所下降。推测在苦瓜RIP诱 导的HL．60细胞的凋亡过程中，caspase．3表达及活性的升高发挥了至关重 要的作用，Bcl．2和Bax则可能通过其表达量的变化对细胞凋亡进行调控。打 关键词：核糖体失活蛋白假配基亲和层析 凝胶层析 苦瓜 HL．60细胞 Bel．2Bax