第章PCR与DNA测序精要.pptVIP

双脱氧法测序原理示意图 （1）鸟枪法 将长链DNA片段随机断裂成适于序列测定的片段（300-600bp），断裂方法有超声波处理、核酸酶I法和限制酶切割法。 （2）嵌套缺失法（nested deletion,Erase-a-base） ①首先将大片段克隆到测序载体； ②选用两种限制酶从待测DNA片段与载体序列之间将DNA切断,使切割后近载体端为3`突出的粘性末端，近待测DNA的末端为5`突出的粘性末端或平端； 大片段DNA序列测定的策略 ③用外切核酸酶III消化上述线性DNA（37?C，250核苷酸/min），在不同时间终止反应，可以获得在同一端缺失并依次相差200-250bp的DNA片段。 ④用核酸酶S1消化末端的单链，使之成平端，经T4 DNA连接酶连接环化，得到一套缺失长度不同的DNA片段克隆； ⑤将各个克隆从其缺失端开始用通用引物测序。由于引物相同，测序结果可以从子片段序列的相互重叠部分准确无误地将相邻片段的序列拼接起来。 引物 E B 目的片段 B E BamH I 5` 3` Exo III S1 T4 ligase tttgggcccaaa atcggggctg……ggcatagt tttgggcccaaa ggcatagt……….cgatcag tttgggcccaaa cgatcagcg…..tcagtcgtag tttgggcccaaa tcagtcgtagcgtagcta…..gggaa 引物 拼接方向 测序 每次测序的长度是有限的 （3）引物延伸法 从DNA的3′端依赖特定引物延伸测定一段DNA序列，再根据测得序列设计新的引物，如此逐步推进。 一轮 随机引物 作为二轮的引物 测出的序列 二轮 三轮 几乎与双脱氧链终止法建立的同时，Maxam和Gilbert于1977年建立了一种以化学修饰为基础的DNA序列分析法，称为Maxam-Gilbert化学修饰法。 二、Maxam-Gilbert化学修饰法 （一） Maxam-Gilbert化学修饰法原理 基本原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混和物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影，便可根据X线片底板上显示相应带谱，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。 化学修饰法的待测DNA片段有的是双链，有的是单链DNA。在进行碱基特异性化学切割反应前，首先对待测DNA片段作末端标记，使其末端(5′端或者是3′端)带上放射标记。如果待测DNA是双链，必须使其形成末端标记的单链。 对末端标记的DNA链进行化学断裂反应分两步进行： 第一步是在4个反应管中分别以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸对特定的碱基进行化学修饰； 第二步是以六氢吡啶取代被修饰的碱基并将DNA链断裂。 DNA化学裂解反应体系 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C和T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢