第十章生物技术资料.ppt

本章小结与思考题： 农杆菌T-DNA导入植物基因组整个过程？ 影响T-DNA转移的主要因素有哪些？ 请选取一种植物，写出农杆菌介导的转基因的整个过程，并画出线路图。 基因枪法转基因的优缺点有哪些？ 第10章 植物遗传转化技术和方法 第10章 植物遗传转化技术和方法 谢谢大家 早在六、七十年代，人们就仿效细菌转化方法开展了植物转基因的尝试 这些早期的研究虽然算不上完备的植物基因转化，但为后来的植物转基因方法和体系的建立做了有益的探索 尝试阶段 ※ 1969年，Ledoux等用细菌DNA浸泡大麦的幼苗，通过对抽提DNA的沉降分析，发现转化大麦的DNA中存在中间密度的DNA带 ※ 1974年，他们进一步用同种细菌的DNA浸泡维生素B1缺陷型的拟南芥种子，结果观察到有少数浸泡的后代植株能在缺乏维生素B1的培养基上生长 ※1974年，Hess等用来源于红花矮牵牛的总DNA浸泡白色矮牵牛的种子，观察到少数后代植株开红花 ※1976年Hess等进一步用人工培养萌发的花粉与外源总DNA溶液混合授粉，结果在后代植株中发现了外源基因表达的性状，并检测到外源基因表达的酶活性 2 发展阶段 ※ 1983年第一株转基因烟草（Zambryski,1983）的获得标志着植物转基因时代的到来 ※ 1984年，PEG的方法将NPTII转入烟草 ※ 1985年，Horsh等创立了农杆菌介导的“叶盘法”转基因系统，具有里程碑的意义，至今仍被许多双子叶植物和一些单子叶植物转基因工作采用 ※ 马铃薯（McCormick等1986年），棉花（Umback等1987年），油菜（Fry等1987年）大豆（Hinchee等，1988年） ※ 1987年Sanford等发明了基因枪，同年Klein首次将其用于植物转基因研究，克服了当时农杆菌介导的转基因方法的受体种类和基因型的限制，开创了植物转基因方法的新领域 ※ 1988年McCabe等利用基因枪法转化大豆幼胚和成熟胚的下胚轴获得了转基因再生植株。 ※ 1990年，Formm等和Gordon-Kamm等成功转化了玉米胚性愈伤组织。 ※ 小麦（ 1990年Vasil等），大麦（ 1994年Wan等） ※ 1994年，Hiei等通过使用农杆菌侵染诱导剂乙酰丁香酮（AS）以及构建VirG和VirB高效表达的超双元载体，高效成功地转化了水稻。 在这转基因系统的基础上，lshida等1996年，Tingay等1997年，Cheng等1997年相继获得了玉米、大麦和小麦的转基因植株。 3 商业化发展阶段※全世界转基因植物涉及到30多个科的200多个种，涵盖了绝大多数主要经济作物、观赏植物、药用植物、蔬菜、果树、树木和牧草。※至少30个国家进行了总计3万次以上的转基因作物的田间试验，改良的作物经济性状有十多个；已有大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、马铃薯、烟草、西葫芦和蕃木瓜等九种作物的转基因品种投入了商业化生产。 * 已发表的植物转基因操作体系有近十种。目前应用最多的是根癌农杆菌介导的转基因方法和基因枪介导的转基因方法。 根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法是目前研究最多，机理最清楚，技术方法最成熟的转基因方法 迄今所获得的200多种转基因植物中，80%以上是利用根癌农杆菌Ti质粒介导的转基因方法产生的 * 染色体背景为C58的菌株生长速率快，不结球，染色体背景为Ach5的菌株生长慢，培养过程中结球。 * * Vir区基因在接受植物细胞产生的创伤信号分子后，首先是VirA编码一种结合在膜上的化学受体蛋白。 VirA蛋白可直接对植物产生的酚类化合物感应。当酚类物质（如乙酰丁香酮）与感应位点结合后，会使整个VirA蛋白构象发生变化，其C端活化。C端有激酶的功能，使蛋白上的组氨酸残基发生磷酸化，从而激活VirA蛋白。被激活的VirA蛋白可以转移其磷酸基团至VirG蛋白，使Vir族蛋白活化。 VirG编码DNA结合活化蛋白 当VirG蛋白活化后，以二聚体或多聚体形式结合到Vir启动子的特定区域，从而成为其它Vir基因转录的激活因子，打开VirB等基因簇。 * * * 外植体的接种时间和接种农杆菌菌液的浓度因物种和外植体的类型不同而不同。 接种时间过长及接种菌液浓度过高，容易引起后续培养中的污染 而接种时间太短和接种菌液浓度过低，又造成转化效率降低。 一般接种时间为1～30min，接种菌液浓度为0.3～1.5OD， 不同作物适宜的接种的时间和接种菌液浓度 * 共培养时间不宜太长，否则，可能会由于农杆菌的过度生长而使植物细胞受到毒害而死亡。一般共培养时间为3d。 多数共培养基中加入AS和单糖类化学诱导物；并加入较高量的生长素类（如2,4-D）激素，而避免使用细胞分裂素类（如BA和TDZ）激素。 * * * 带有目的基因的克隆载体 氯化钙沉