小鼠甲状腺过氧物phe473-ala800多肽的表达与纯化.pdf

㈣ⅢlIllllllI|…川lIl||姗IIlII|lIlI 900580 Y1 目 录 中文摘要…………………………………………………………………l 英文摘要…………………………………………………………………3 研究论文 小鼠甲状腺过氧化物酶Phe473．Ala800多肽的表达与纯化 前言…………………………………………………………………6刚吾”一“”一”“一”“”””一“”一””“””””””””一””一“一”“”‘6 材料与方法…………………………………………………………6 结果························…············………······-·················…22 附图·········…············………···…………···…······-···········…25 讨论···········································································32 结论······……………···……………………………………………37 参考文献……………………………………………………………37 综述 自身免疫性甲状腺炎研究进展…………………………………42 致{射··········································································-······50 个人简历…………………………………………………………………5l 中文摘要 摘 要 自身免疫性甲状腺炎(autoimmune (Hashimoto’s 过氧化物酶(t咖oid autoiI姗une 模拟人的自身免疫性甲状腺炎，最常用的是小鼠模型，尤其是H．2k和H．25 单元型小鼠等有较重的甲状腺浸润，能更好的反应甲状腺炎的状况。 甲状腺过氧化物酶(TPO)是一种糖基化血红素蛋白，跨于甲状腺细胞 项缘的细胞膜上，是甲状腺激素合成的关键酶，也是引起自身免疫性甲状 (TPOAb)的免疫反应，常是引起HT患者甲状腺细胞损伤的重要机制。 本实验旨在通过原核表达系统，表达和纯化小鼠甲状腺过氧化物酶 Phe473．Ala800多肽(mouse thyroidperoxidase，mTPOF473·A800)。 在Rosseta菌中诱导表达，纯化mTPOF473诅800蛋白。 方法： 60mg，液氮冷冻，研钵研磨组织，提取总RNA。 2扩增目的基因。RT-PCR法扩增mTPOF473-A800基因 养基，37℃过夜培养，次日取1ul菌液做菌液PCR，初步筛选阳性菌株。 将阳性菌液作质粒小提，质粒经Eco对／XhoI双酶切鉴定，挑选阳性的重 组克隆载体10ul送华大基因公司测序。 经DNA连接酶做连接反应，将连接产物转化DH50【感受态细胞，次日取 中文摘要 1ul菌液做菌液PCR，初步筛选阳性菌株。将阳性菌液作质粒小提，质粒 R∞s2幻 经Eco蚴oI双酶切鉴定，挑选阳性的重组表达载体转化EcDJ『f 感受态细胞，做诱导表达，筛选表达量高的重组表达载体，后进行表达条 件的优化。 5 m仰OF473-A800蛋白。 结果： l提取总RNA，肛PCR 列正确。 2重组表达载体的构建与表达条件的优化。通过双酶切鉴定， EcDlIf IPTG。 达mTPOF473