植物叶绿体遗传转化的研究.pdf

摘要 摘 要 ’7 叶绿体(chloroplast)是高等植物细胞中重要的细胞器，它除进行光合作用外 还参与脂肪酸、核苷酸、淀粉和氨基酸等许多物质的生物合成。叶绿体还是一 个半自主性的细胞器，含有自己的基因组DNA(chloroplastDNA，ctDNA)，能够 进行自我复制、转录及合成蛋白质，至少有100余种叶绿体特有的蛋白质是在 叶绿体内部合成的。与传统的核转化相比，叶绿体转化具有无可比拟的优越性。 这一领域的相关研究不仅在理论上极大地丰富了有关叶绿体的研究，并为细胞 器转化、构建新型生物反应器(bioreactor)等奠定了坚实的基础。 Sidorov等的研究表明：在漫长的演变进化过程中，叶绿体基因组的结构非 常保守。在作物之间，不一定必须构建特定的载体进行转化。因此，本研究在含 有壮观霉素抗性(spectinomycin Fluorescent 能够长期稳定存在的黄瓜线粒体类质粒pC3全序列，构建黄瓜叶绿体表达载体 pDK53-pC3，以期增加黄瓜叶绿体转化过程中载体整合或独立存在的机会。 本研究以“津研4号黄瓜为试材，首先分离纯化黄瓜叶绿体，摸索其体 外培养条件，通过显微观察、台盼蓝染色、希尔反应及bⅪ染色等方法检测叶 绿体体外培养效果，取得了较为理想的结果。进一步向培养体系中添加氨基酸、 激素、各种营养物质以及改变培养体系pH等以期优化叶绿体体外培养条件，但 并未取得明显效果。 对黄瓜离体叶绿体的电转化条件进行探索，用电转化方法将构建的带有外 源基因的表达载体转入黄瓜离体叶绿体中，通过PCR扩增外源基因．咖，证明叶 绿体表达载体pDK53、pDK53．pC3已经成功转入离体的黄瓜叶绿体中，并且叶 绿体在体外培养18天甚至更长时间时，转入的外源DNA仍然可以检测到。但 是，质粒在离体叶绿体中的存在方式、外源基因的转录及表达情况尚未可知， 确切的结论还有待进一步研究。 reinhardtii)含有1个大型杯状叶绿体，约占整 莱茵衣藻(Chlamydomonas 个细胞体积的40％-60％。本研究以莱茵衣藻细胞壁和精氨酸缺陷型CWl5品 系为试材，采用电转化方法将烟草叶绿体表达载体pDK53导入衣藻叶绿体中， 摘要 通过PCR扩增外源基因曲和荧光显微镜观察，证明叶绿体表达载体pDK53已 经成功转入衣藻叶绿体中。但是在对衣藻转化子进行同质化筛选过程中，外源 基因丢失了。 此外，本研究以“津研4号’’黄瓜子叶和下胚轴为外植体，比较了外植体 切割和接种方式以及不同植物生长调节物质组合对不定芽的诱导、伸长、生根 的影响。结果表明，子叶能够直接再生出芽；下胚轴只长愈伤组织，没有见到 芽的分化。最佳的芽诱导培养基为：MS+6-BA 2mg／L+L认0．5mg／L,伸长培 养基为：MS+6．BA 0．5mg／L+GA30．5mg／L；生根培养基为MS或1／2MS。 关键词：叶绿体转化电转化黄瓜培养莱茵衣藻 Abstract to cell in addition all higherplant．In is organelle important Chloroplast of asta埘 in substances，such