16基因工程和蛋白质工程要点.ppt

第十六章基因工程与蛋白质工程 第一节 生物工程概述 第一节 生物工程概述 一、生物工程概念及研究技术 一、生物工程的概念及研究技术 1.基因工程——在分子水平的遗传操作技术 二、生物工程在现代工、农、医领域中的应用 1.化工及冶金工业 第二节 基因工程 DNA重组的 技术路线 一、目的基因的获得 1.限制酶——特异性切割DNA的手术刀 1. 限制性内切酶 DNA重组即是将两种DNA分子经过切割，选择适合的片段连接起来的过程 实现这一步，是在限制性内切酶发现以后才实现的 限制性内切酶的命名 用细菌同名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）构成酶的基本名称。若酶是从其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加上菌株名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如HaeII是从（Haemophilus aegypticus）中提取的，并且是从中发现的第二个酶。 限制性内切酶切割DNA的方式 a.从识别序列的中间切开 b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割 c.在识别序列对称轴的右边（5’-3’链）和对称轴左边（3’-5’链）切开 a.从识别序列的中间切开 从识别序列的中间切开产生平齐末端（bluntends）， 如HaeⅢ b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割 即分别在5’-3’链和3’-5’链对称轴的左右方切开 ，形成带有凸出的5’磷酸基团的粘性末端（Cohesive ends），如EcoRⅠ c.在识别序列对称轴的右边（5’-3’链）和对称轴左边（3’-5’链）切开 形成带有凸出的3’羟基的粘性末端，如pstI 2.取得目的基因的方法 ——分离法及合成法 （1）DNA片段的直接提取 二、基因载体 1.质粒——染色体以外的遗传单元 质粒是一种环状双链的DNA分子。自身在细菌细胞中能不断复制繁殖。研究比较深入的质粒有大肠杆菌的性因子（F因子）、大肠杆菌素因子和抗药因子等 质粒的作用 质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌。这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增殖。 质粒自身的某些抗药基因成为从转化的细菌中筛选它们的一种标记。除质粒外，噬菌体、病毒也能通过“感染”将外源基因带入细菌并进行复制。 目前所使用的质粒 目前实验中所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种类很多。但都是经过了人工改造，更适宜运用于DNA重组技术。它们既保留了转化和感染活细胞的能力，又具有多处携带外源DNA的酶切位点，并含有特殊的筛选标记 这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；有些可以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋白质产物，这种载体称为表达载体 pBR322质粒的结构 以噬菌体或病毒为载体，将所需基因或含有此基因的DNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导。 我们常常采用?噬菌体作为基因工程的载体，其一它的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于使细胞感染，易于使外源DNA导入宿主细胞。 以?噬菌体为载体进行DNA克隆 三、重组DNA的筛选及表达 1.转化——带有目的基因的载体进入受体细胞 1.转化——带有目的基因的载体进入受体细胞 由质粒作载体形成的克隆，转入细菌时细菌预先要在低温条件下用氯化钙处理，形成“感受态”细胞。即增加细胞膜的通透性才能实现转化。 由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为“侵染”。因噬菌体具有自动侵入的功能。细菌不用预先处理。 ?噬菌体感染大肠杆菌的途径 pBR322质粒结构 Southern和Western印迹法 3.表达——外源DNA在受体细胞中的转录和翻译 带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽。 第三节 蛋白质工程 一、蛋白质工程的概念 蛋白质工程(protein engineering)：通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质技术 蛋白质工程 举例： 定点突变技术： 已知丝氨酸是由TCT编码，只要把C改为G，就变成半胱氨酸的密码TGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，引物里含有TGT外，其余均与基因部分互补。打开含有被突变蛋白质基因的质粒的双条链成单链模板，用引物与之互补链退火（假如退火在适宜温