基因工程第四章基因工程的主要技术原理教程分析.ppt

作业：P95 1、3、6、7、8、11、12 7. PCR技术的应用 （1）扩增某一段DNA 从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增； 微量残留DNA扩增； 分析模板序列； 在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。 （2）基因的体外诱变 技术关键： 利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。 设计引物定点诱变 利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。 （3）基因组的比较研究 比较不同物种之间的基因组特征和相似性。 类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) 1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题： 当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。 当时的分析思路局限于RNA序列分析法。 第五节 DNA序列分析 （1965年Cornell大学的S.W. Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片断法）。 Sanger等1977年发明。 一、双脱氧链终止法 Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖 （1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配 对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以3’?5’磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。 （4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终 止。 1. 原理 （1）制备单链DNA模板 2. 技术要点 就是待测序的 DNA链。 ①不能有5’?3’和3’?5’的外切酶活性； ②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。 （3）特殊的DNA多聚酶 dNTP / ddNTP = 100 / 1 （4）制备2’和3’双脱氧的ddNTP 时, DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。 需带有放射性或荧光标记。 （2）制备一小段单链引物（DNA或RNA） 3. Sanger双脱氧终止法测序过程 双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。 TGCATGCAT ATCTTGAAC TAGAACTTG ACGTACGTA TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ TAGAACTTG ACGTACGTA 95oC （1）DNA模板变性 模板 模板（template） 95oC TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。 （2）DNA模板与引物复性 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ 引物 引物 引物（primer）: 40-65oC DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。 （3）DNA链的延伸 TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ ACGTACGTA 5’ Taq Taq 72oC 理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。 变性—复性—延伸。 （5）1个循环的结果 （4）新一轮循环开始 DNA elongation 3. PCR的过程 （1）第一步 变性（denature） 94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。 （2）第二步 复性（anneal） 50-60 oC下1分钟，引物优先与模板复性。 ① 引物的浓度高， ② 引物的链短。 94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。 （4）第四步 变性（denature） 72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。 （3）第三步 延伸（extend） （5）第五步 重复（repeat） 第二步——第三步——第四步 复性 延伸 变性 95oC 5min 50oC 1min 72oC 2min 94oC 1min 温度循环 需要的模板量极低。 4. PCR的特点 （1）特异性强 ① PCR使用专门合成的DNA引物。 ② 延伸过程是在高温下进行。 （2）敏感性高 这就避免了一般DNA聚合酶污