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Molecular Biomarkers in Molecular Diagnostics DNA RNA PROTEINS Metabolic substrates DNA polymorphisms-RFLP DNA polymorphisms-VNTR DNA polymorphisms-VNTR DNA polymorphisms-SNP Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。 是由Alwine于1977年建立的。后经Thomas等人改进。 主要用于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况。 与Southern印迹杂交比较： RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染 所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用 RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA 2-OH 变性剂的作用：防止RNA分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态 PCR 循环- 第一步 – 加热变性 PCR 循环- 第二步 – 引物与模板DNA分子退火 PCR 循环- 第三步 - 引物延伸 第1个 PCR 循环完成后 －－得到两个拷贝的靶序列 30次循环后靶序列扩增的数量 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1. 荧光染料法 SYBR荧光染料 (SYBR Green based Quantitative PCR) 能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 此方法未使用目的特异性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差别不大。 2. 荧光探针法 Taqman技术 （TaqMan probe） DNA sequencing 第一代：双脱氧核苷酸末端终止法 DNA sequencing 第二代：焦磷酸测序（Pyrosequencing） DNA sequencing 第三代：单分子实时测序 （Single Molecule Real Time Sequencing , SMRT) 产前诊断 Prenatal Diagnosis 遗传学检查 细胞培养、染色体检查、分子诊断等 生化检查 特殊蛋白质、酶、代谢底物、中间产物和终产物等 物理诊断 B超、X线、胎儿镜、电子监护等 羊膜穿刺 妊娠16-20周 绒毛取样 妊娠9-12周 invasive prenatal diagnosis Other sources of fetal tissue for PND Difficult to isolate and persist for years after pregnancy Fetal cells in maternal circulation erythroblasts trophoblastic cells leucocytes Cell free fetal DNA in the maternal circulation Detectable from 5 weeks’ Cleared from circulation within 30 minutes of delivery 3 – 6% of total circulating cell free DNA Originates from trophoblast 与目标序列互补 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 TaqMan技术原理示意图 3’端的荧光Q分子吸收5’端荧光R分子的荧光信号 探针5’端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来 荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例 5’ 3’ 5’ 3’ Q R Q 5’ 3’ R 5’ 3’ 激发 5’ 3’ 5’ 3’ 激发 R Q 引物 Taq 酶 DNA Microarray DNA芯片技术 DNA Microarray DNA芯片