Chapter亲和纯化资料.pptVIP

* 第五节　亲和色谱过程分析 亲和色谱操作过程 上样吸附 清洗（洗涤） 洗脱 再生 1、进料吸附（p329) 亲和色谱操作中可能存在的两种吸附： 亲和吸附：亲和配基与目标分子间的特异性结合 （选择性高） 非特异性吸附：料液中各种溶质（包括目标产物）与固定相介质和配基分子中的某些部位的疏水性和静电相互作用（选择性低） 基本要求： 1）亲和吸附介质对目标产物有较高的亲和吸附作用和吸附容量 2）杂质的非特异性吸附需控制在最低水平 缓冲液的离子强度要适当（0.1-0.5mol/l) 缓冲液的pH应使配基和目标产物与杂质的静电作用较小 加入表面活性剂减少杂质以及目标产物的非特异性疏水性吸附 注意事项（p330) 样品液的浓度不宜过高 上样时流速比较慢 样品缓冲液中有一定的的离子强度 上样时选择适当较低的温度 2.清洗 目的：洗去色谱柱空隙和吸附剂内部存在的杂质 清洗液：采用与吸附操作相同的缓冲液（PH和离子强度相同），必要时加入表面活性剂 清洗操作时间：根据色谱流出液的组成变化情况而定，避免过度清洗（回收率降低）或清洗不充分（纯度降低） 3、洗脱 特异性洗脱 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。 非特异性洗脱 通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和作用，使之脱附，较多采用 特异性洗脱 优点： 特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。 洗脱条件温和，可避免目标产物失活 缺点： 　洗脱时间较长 改善方法： 选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度 特异性洗脱 非特异性洗脱 与配体亲和力较小时 连续大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。 配体结合较强时 适当的pH、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性 与配体结合非常牢固时 使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性（需慎用） 逐次降低洗脱液PH的非特异性洗脱 3、吸附剂的再生和保存 再生 用大量清洗液洗涤 严重的不可逆吸附时，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶 保存 加入0.01%的叠氮化钠，4°C 下保存 亲和色谱的特点 优点： 　纯化过程简单、迅速； 　分离效率最高。 　条件温和（适用于含量极少又不稳定的活性物质）。 缺点： 　必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，亲和吸附剂价格昂贵，其应用范围受到限制。 是一种高度分离纯化蛋白的方法，有时只用亲和色谱即可使纯度提高1000至10000倍。） 三、应用 　　1.酶、酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离和精制 　（组织纤溶酶原激活剂，干扰素，脱氢酶，淀粉酶抑制剂，基因重组蛋白） 2.分辨化学或遗传学上修饰的酶 3.纯化亲和标记的活性中心肽段和蛋白质 结构研究 4.纯化人工合成的多肽和蛋白质 5.解释酶作用机理 第三节 亲和膜 一、原理 利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是亲和层析的变形，故又称膜亲和层析。 二、应用及特点 应用：单克隆抗体的纯化、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）的纯化等。 特点 优点 传质阻力小，达到吸附平衡时间短，配基利用率高； 压降小，流速高，设备体积小，配基用量低。 缺点 理论板数很低，吸附和清洗效率低； 膜的污染会使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降。 第四节 亲和错流过滤 一、原理和操作 原理：ACFF又称亲和过滤或亲和超滤，是生物亲和作用与膜分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术，是亲和层析的另一种变形。 操作：进料吸附、清洗、洗脱和再生等步骤。 二、应用和特点 应用：如伴刀豆球蛋白（con A）的纯化，连续亲和循环提取（CARE）纯化?-半乳糖苷酶等。 特点 优点 以压差为推动力，速度快，易于放大和实现连续化操作； 选择性高，纯化水平接近或达到亲和层析； 载体一般为水溶性聚合物或无孔微粒，无内扩散传质阻力，目标分子的亲和结合速度快； 不需使用高压设备，可弥补高效亲和层析设备昂贵、放大困难的缺点。 缺点 相当于层析过程的一个理论板，分离效率较低。 第五节 其他亲和纯 化技术 一、亲和双水相分配 原理：利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。 操作：包括亲和分配（进料）、杂蛋白反萃取（清洗）和目标产物反萃取（洗脱）等步骤。 二、亲和反胶团萃