核酸的研究方法-王镜岩生物化学(全)资料.pptVIP

人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 第16章 核酸的研究方法 第一节  核酸的分离、提纯和定量测定 核酸制备的原则 核酸制备中共同需要注意的问题是防止核酸的降解和变性，要制备天然状态的核酸，必须采用温和的条件，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用（在0℃下操作）。 真核生物的DNP(DNA+Pro)溶于水和浓盐溶液(1MNacl),但不溶于生理盐溶液( 0.14MNacl)；而RNP则溶于生理盐溶液，不溶于浓盐溶液，利用此，即可将DNP和 RNP分开。 再利用苯酚或氯仿-异戊醇或SDS+广谱蛋白酶去除蛋白质 一、DNA的分离 一、DNA的分离 浓盐法： SDS-浓盐buffer破碎细胞 离心，取上清 加水，使DNP沉淀 酚/氯仿去蛋白，纯化 二、RNA的分离 制备RNA通常需要注意3点： ①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。 ②在破碎细胞的同时加入强变性剂(如胍盐)使RNase失活。 ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂(如RNasin)。 常用的制备RNA方法 （1）不同功能RNA常分布于细胞的不同部位，分离这些RNA常需先用差速离心法，将细胞核、线粒体、叶绿体、胞质体等各部分分开，再从这些部分中分离出RNA。 （2）分离方法：用异硫氰酸胍／苯酚／氯仿抽提。 （3）分离poly(A) mRNA通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸(oligo(dT))亲和层析法 三、核酸含量的测定法 1.紫外分光光度法（260nm） 2.定磷法 先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝（660nm），通过测定磷含量计算出核酸含量 3.定糖法 （1）当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚(地衣酚)反应呈鲜绿色（670nm），反应需要三氯化铁作催化剂 （2）DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595nm处 第二节 核酸的凝胶电泳 常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。 一、琼脂糖凝胶电泳（水平） 常用于分析DNA和RNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质，所以用于分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等 1、决定电泳的迁移率的因素见516页。 2、DNA的加样量与加样方法。 A：浓度太高，易产生拖尾与弥散现象；太少，分辨不清。一般0.1ugDNA已足够肉眼观察。 B：样品液要与样品缓冲液（溴芬兰指示剂+50%蔗糖）混合。加样体积15-40ul,样品缓冲液占1/5。 3、EB（溴化乙锭）染色 A：在胶中和电泳缓冲液中同时加入0.5ug/mlEB。 B：只在胶中加入0.5ug/mlEB。 C：电泳完毕后，将胶放在含有0.5ug/ml的EB电极缓冲液中染色10—30分钟。 经紫外光照射可发射出红橙色荧光 琼脂糖凝胶电泳的应用 1. 可以确定是否存在核酸物质。 2.可以近似测定DNA片段的分子大小和含量 3.凝胶上的样品可以回收，以供进一步研究 1000bp 2000bp 1500bp 750bp 500bp 250bp 二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的孔径比琼脂糖胶要小，所以可用于分析相对分子质量小于1000bp的DNA片段和RNA的片段。分辨率很高，只相差1个bp的核酸片段也能分开。 聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，用于RNA的分析不会分解样品 第三节 核酸的核苷酸序列测定 一、酶法测序 又称 “加减法” Sanger于1975年设计，工作原理： 先随机合成片段，然后除去4种dNTP 分为8份 只加一种dNTP 只减一种dNTP加三种 -G —ATGCTG —TACGAC —TACGAC —TACGAC —TAC —TAC —TAC —ATGCTG —TACGAC —TACGA —TACG —TAC —TA —T —ATGCTG —TACGAC —TACGA —TACGA —TACGA —TA —TA -C —ATGCTG —TACGAC —TACGAC —TA