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双链DNA 变性 单链 随机引物 Klenow DNA聚合酶 α-32P-dCTP 变性 32P-标记的单链DNA探针 随机引物标记基本原理 The Klenow fragment 去除了E. coli DNA polymerase I 的5’→3’的外切酶活性，具有5’→3’的聚合酶活性及3’ →5’ 外切酶活性。在pH 6.6的条件下，3’ →5’ 外切酶活性被大大降低（有的公司提供无该酶活性的酶） 随机Primer：可通过用DNase I 消化牛胸腺DNA、DNA合成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针DNA的平均长度与引物的浓度成反比[=k/(lnPc)1/2, Pc 是引物的浓度]，一般可产生~400-600 bp 的标记产物。 随机引物标记体系 模板DNA：一般为线状双链DNA α-32P-d CTP： (放射性比活3000Ci/mmol)?，半衰期14.3天，最大能量1.71 Mev，最大辐射范围：空气中610cm，水中0.8cm，有机玻璃中0.76cm。 或DIG-11-dUTP标记： 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * * DNA (５ ?g) 7 ?l 10*buffer reaction 2 ?l Enzyme (10U) 1?l (10U/?l ) ddH2O 10 ?l 20 ?l 酶切的一般体系： 注意：冰上操作 1 × 5× DNA 7 ?l HindIII (10U/μl) 1 ?l 5 ?l 10×buffer 2 ?l 10?l ddH2O 10 ?l 50?l Total 20 ?l 37°C 酶切过夜 本实验酶切体系 混匀分装 电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测。 若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则重做 。 出现切烂：DNA降解，重新提DNA； 切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化。? 酶切效果检测 A1优总DNA A2劣总DNA B1 酶切烂 B2酶切优 B3切不动 总DNA酶切电泳检测 12 1 2 3 4 5 6 7 9 (kb) 1 2 3 35 显影后的杂交结果 酶切反应的终止 加入终浓度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应 多数酶在65°C 10分钟可被不可逆灭活，少数65°C不失活的酶在75 °C 15分钟也能失活 若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化 造成DNA酶切不完全的主要原因 DNA问题：不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；被甲基化；酶切后DNA粘末端退火；识别位点的两侧插入了影响酶切效率的序列； 操作不当：酶或DNA粘在管壁上，反应体系没完全混合；酶粘度大，取样不准或酶稀释不正确； 反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适; 酶的问题：活力不够；强烈振荡使酶变性；过度稀释使酶活性降低等。 DNA样品中抑制酶活的主要污染物 DNA 样品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性。 解决办法： 增加酶作用的单位数（10-20U/μg DNA)； 增大反应体积以稀释可能的抑制剂； 延长反应时间； 消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物； 纯化DNA。 胶浓度0.7-0.8%。 胶厚度 5mm (250ml胶)，用1倍TAE配制。 胶的