第一章核酸的高级结构资料.ppt

真核生物核蛋白体 以小鼠肝细胞为例：共有四种rRNA 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA 小亚基含18S rRNA和30多种蛋白质； 大亚基含28S、5.8S、5S三种rRNA，近50种蛋白质。 第五节 核酸的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid 一、核酸的一般理化性质 1、大分子性质： 核酸的分子量很大，一般为106～1010。核酸溶液粘度大(抗剪切力差)。 粘度：DNARNA 2、溶解性： DAN为白色纤维状固体，RNA为白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。常用乙醇从溶液中沉淀核酸。 3、核酸的酸碱性质: 核酸中的磷酸和碱基均能发生两性解离。核酸是两性电解质。因磷酸的酸性强，通常表现为酸性。 DNA等电点 4—4.5；RNA等电点 2—2.5。 4、紫外吸收 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应） OD260的应用 二、DNA变性和复性 1、概念：在某些理化因素作用下，DNA的分子量不变，二级结构中的氢键遭到破坏，使DNA双螺旋结构部分解体；或维系DNA分子二级结构的氢键全部破坏，双螺旋解旋分离成两条DNA单链，即分子量二分化的过程。 (一)DNA变性 两条单链 继续 迅速冷却 DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 ▲ 实质： 破坏DNA的空间结构 OD260增高(增色效应）； 粘度下降； 比旋度下降； 浮力密度升高； 酸碱滴定曲线改变； 生物活性丧失。 2、变性后的理化性质 ： (二)DNA复性 1、概念： 变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这称为复性。 退火:复性时需较为缓慢的逐渐进行，也称退火。 Tm -25℃是较合适的复性温度。 2、影响复性速度的因素 单链片段浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。 较大的单链片段扩散困难，链间错配频率高，复性较慢。 片段内重复序列多，则容易形成互补区，因而复性较快。 维持溶液一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的斥力，可加快复性速度。 (三)影响DNA变性的因素 酸 碱 热 变性剂 （尿素） 有机溶剂 （乙醇） Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度，又称融解温度(melting temperature, Tm)。其大小与G+C含量成正比。 （一）温度对DNA变性的影响 DNA的Tm一般在70～85℃之间。 例：变性引起紫外吸收值的改变 DNA的紫外吸收光谱 增色效应：DNA变性熔解时，DNA的紫外吸收光密度将出现由低到高的急剧变化，而最大吸收波长不变的现象。 热变性 解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。 酸碱的作用，或者说介质中pH的改变，可导致DNA变性。原因： 在酸性条件下，以氢键形式存在的-NH2被滴定， 在碱性条件下，以氢键形式存在的酮基将转变为烯醇式羟基而被滴定，从而导致氢键破坏的缘故。 （二）pH对DNA变性的影响 在25℃、0.05mol/L NaCl 溶液中，从中性到pH4.5左右约发生10%的酸变性，在这一pH范围内的变性是可逆的。若pH继续下降，则变性程度随之加深，至pH3左右，不可逆变性增加；若降至pH3以下，则发生完全不可逆变性。 当介质pH上升到11～12之间，发生不可逆变性，超过12，则发生完全不可逆变性。 通常，当介质pH在5.5～8.5的范围内室，DNA的Tm值变化不大。 （二）pH对DNA变性的影响 此外，酸碱变性还与DNA的碱基组成有关。 GC含量丰富的DNA对酸碱抗性大， 这与GC比AT能多形成一对氢键有关。 （二）pH对DNA变性的影响 在中性条件下，由于DNA中存在许多GC碱基对，从而增加了DNA抗热变性