第十六章转基因技术与作物育种(一)解读.pptVIP

MCS 引物（primer）:是一段特定的DNA序列，在退火温度下和模板链特异性结合，引导PCR体系中的dNTP根据碱基配对原则延伸出一条新的链。 引物种类 Oligo(dT) 随机引物：RAPD 特异性引物：SSR、ISSR、SRAP、Scot 通用引物：一般和载体多克隆位点两旁的序列匹配 简并引物：是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。 双元表达载体：由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。 辅助Ti质粒(又称卸甲Ti质粒)：含有Vir区，用于激活T-DNA的转移。 (由经改靠的农杆菌EHA105、LBA4404提供) 微型Ti质粒：含T-DNA边界，缺少Vir区，是一种穿梭载体。 (如pBIN19, pBI121) 构建原理：将微型质粒转入到含有辅助性Ti质粒农杆菌的途径有两条：一条是直接用纯化的微型Ti质粒转化速冻的根癌农杆菌感受态细胞；另一条途径是采用三亲交配方法。三亲交配由含微型Ti质粒的E.coli、含有助动质粒pRK2013的E.coli和含有辅助Ti质粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌间的接合转导。pRK2013可移入农杆菌，但由于不能自主复制而被丢失，其进入含有微型Ti质粒的E.coli后，可促进微型Ti质粒一起或分别转入农杆菌中。由于pRK2013的“自杀”特性，最终在农杆菌中剩下含有微型Ti质粒和辅助Ti质粒的双元载体，此农杆菌可直接用于植物细胞转化。 优点：双元载体无需两个载体的共整合过程，因此构建的操作过程比较简单；由于微型Ti质粒较小，并无共整合过程，因此质粒转移到农杆菌比较容易，且构建的频率较高。另外，双元载体在外源基因的植物转化中效率高于一元载体。 一元载体 双元载体 (三)目的基因：基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和得到表达产物的基因。 目的基因一般为结构基因，也就是能转录和翻译出多肽(蛋白质)的基因。 根据获得基因的途径主要可以分为两大类： 根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆； 从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。 1.根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆 主要步骤如下： 利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。 虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。 局限性：兼并密码子 效率低 未知基因及产物 分离蛋白质 明确氨基酸序列 推导核苷酸序列 人工合成 功能鉴定 2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因 (1)同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。 氨基酸序列比较 设计简并引物 PCR扩增 文库筛选/RACE ? ? (4)T-克隆载体 线状的 (二)噬菌体和病毒载体 1、λ噬菌体载体 线状双链 DNA全长49kb(48502bp) 　 λDNA进入寄主细胞后，含有12个核苷酸的粘性末端互补配对形成双链环状分子，结合处称为cos位点。 λ噬菌体的特点 1) 具cos位点 (cohesive end, cos ) 作用：识别噬菌体的外壳蛋白，是噬菌体包装的必需序列。 　　λ DNA可以整合到寄主细胞染色体，以溶原状态存在，并随染色体的复制而复制。 2)是温和型噬菌体 　　当紫外线或45℃处理，释放出λ DNA，被外壳蛋白包装，成为溶菌状态迅速增殖。 　　λ噬菌体能包装原λ DNA长度的75-105%，约36.4-51kb。 3)中间为非必须区 　　不进行改造，允许承载2.5kb (约5%)的外源DNA。 　　中间有约20 kb的区域对λ噬菌体生长不是绝对必须的。 4)D、E包装必须基因 5)λ DNA上具多个限制性内切酶识别序列 3、柯斯质粒(cosmid)载体 (1)柯斯质粒 “cosmid”一词是由英文“cos site-carrying plasmid”缩写而成的。 所谓柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λDNA粘性末端位点(cos)序列和质粒复制子(ColE1、pMB1)的特殊类型的质粒载体。 (2)柯斯质粒载体的特点 1)环状dsDNA分子，一般在10kb以下。 2)具有λ噬菌体的特性：含有一个cos位点，可以高效地转导对噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。 3)具有质粒的性质：能承载外源片断，转化大肠杆菌，并在其中自行复制和维持。 4)便于筛选：携带质粒的选择标记。 5)具备高容量的克隆能力：分子量较小，能承载比较大的外源片断，40kb，被广泛地应用于构建基因组文库。 6)不会产生子代噬菌体：不含溶菌生长途径。 自主复制序列(ARS，一个或多个) autonomou